新型双荧光探针的开发：靶向线粒体并具有铁螯合能力

荧光探针YBL-1通过TPP+靶向线粒体并选择性淬灭响应Fe3+，合成包含Vilsmeier-Haack反应和Knoevenagel缩合，水溶性好量子产率达0.76，结合光谱和计算验证其作用机制。

　　

卡米洛·塞古拉（Camilo Segura）|奥斯瓦尔多·亚涅斯（Osvaldo Ya?ez）|帕梅拉·J·乌鲁蒂亚（Pamela J. Urrutia）|帕布拉·阿吉雷（Pabla Aguirre）|玛丽亚·基拉克奥（María Quilaqueo）|马科·T·努涅斯（Marco T. Nú?ez）|胡安·希内斯特罗萨（Juan Hinestroza）|玛格丽塔·阿里亚加（Margarita Aliaga）|拉蒙·马丁内斯-马涅斯（Ramón Martínez-Má?ez）|奥利姆波·加西亚-贝尔特兰（Olimpo García-Beltrán）

智利大学（Universidad de Chile）理学院化学系，圣地亚哥7800024

摘要

我们报道了YBL-1的设计、合成和表征工作。YBL-1是一种基于香豆素-三苯基磷鎓（TPP⁺）的荧光探针，专为线粒体靶向和铁离子检测而开发。该探针通过三步合成过程制备，最终使用（溴甲基）三苯基磷鎓溴化物进行季铵化处理。稳态光物理性质显示其溶剂化色变效应较弱（λ_abs 348–355 nm；λ_em 401–408 nm），且荧光转换效率较高（ε_max ≈ 2.2–2.6 × 10⁴ M^-1 cm^-1）。YBL-1在水中仍保持高亮度，量子产率约为0.76。针对常见金属阳离子的筛选结果表明，其对Fe³⁺具有显著的选择性响应。Job分析支持其形成1:1配合物，Benesi–Hildebrand模型显示其在水中的结合常数约为10² M^-1。量子化学计算表明，其荧光激发主要通过π→π*跃迁实现，且电荷转移作用较弱，这与观察到的弱溶剂化色变效应一致。静电势图和种群分析表明，羰基/脲/烷氧基区域是主要的电荷供体位点，这解释了Fe³⁺的结合机制。在用MitoTracker Red共染的SH-SY5Y细胞中，YBL-1与线粒体高度共定位（Pearson r ≈ 0.95），进一步证实了其通过膜电位介导的线粒体靶向能力。这些结果表明YBL-1是一种适用于活细胞成像的、对Fe³⁺具有选择性响应的荧光探针。

引言

线粒体是存在于大多数真核细胞中的关键细胞器，负责能量产生、中间代谢、钙稳态调控、细胞分裂和程序性细胞死亡。它们在线粒体铁稳态中也起着核心作用，因为线粒体是血红素和铁硫（Fe–S）簇生物合成的场所[1]。线粒体内易氧化铁的相对高生物可利用性使其容易受到铁介导的氧化损伤；线粒体铁代谢失调与活性氧（ROS）的产生和Fe–S生物合成障碍密切相关[2],[3]。因此，线粒体功能障碍与多种人类疾病有关，包括Wolcott–Rallison综合征[4]、Shwachman–Diamond综合征[5]、帕金森病[6]、Friedreich共济失调[7]、Charcot–Marie–Tooth病[8]以及产前线粒体疾病[9]。因此，线粒体铁螯合已被提出作为治疗这些疾病的一种策略。

由于线粒体内膜对许多极性小分子具有高度不透性，螯合剂的递送通常依赖于生物活性载体。最常用的载体是分散的亲脂性阳离子（如三苯基磷鎓（TPP⁺），它们首先穿过质膜电位（Δψ_p），然后穿过线粒体膜电位（Δψ_m），从而在线粒体内富集[10],[11]。这种基于膜电位的靶向机制是许多化学生物学和医学应用中TPP⁺衍生物的基础，包括过氧化物酶模拟物[12]、小分子[13]、辅酶Q[14]、维生素E[15]、MitoQ（一种泛醌/泛醇抗氧化剂）及其类似物[16]。已有研究表明，将去铁胺（DFO）与TPP⁺结合可生成一种高效的线粒体铁螯合剂，该螯合剂在细胞中能保持高亲和力并定位于线粒体[17]；相关TPP螯合剂在疾病模型中也显示出生物活性[17]。

除了递送机制外，自2022年以来报道的一系列线粒体靶向荧光探针展示了与此研究相关的多种分析物和设计思路。最新平台包括经过优化以实现强线粒体定位和成像性能的TPP⁺修饰BODIPY染料[18]、能够检测线粒体微环境参数（如极性/粘度）的多功能探针[19]，以及用于检测线粒体超氧阴离子（Mito-YX）的ICT工程传感器[20]和mtDNA靶向报告分子[21]。在铁离子检测方面，已开发出针对Fe³⁺的“开启型”荧光探针，并证实其在活细胞中的线粒体积累[22]；广泛使用的Fe²⁺指示剂Mito-FerroGreen仍在当前研究中用于检测线粒体中的易氧化铁[23]。综合综述强调了TPP⁺引导的探针设计的合理性[24]。

铁离子（Fe³⁺）检测已成为荧光化学传感器开发的重要焦点，这是因为铁离子在铁转运和储存中的作用及其在氧化还原反应中的关键地位。基于罗丹明、荧光素、BODIPY、萘胺、香豆素和吡啶等常见荧光团构建了一系列Fe³⁺响应探针，并结合了特定的电荷供体结构[25],[26],[27],[28]。尽管Fe³⁺具有强顺磁性且常会淬灭荧光，但许多早期设计仍表现出良好的响应特性。尽管存在这一挑战，众多研究仍持续关注Fe³⁺响应荧光剂，为监测细胞内易氧化铁提供了有力工具。

最近，香豆素骨架被改造用于线粒体成像和检测，通过亲脂性阳离子标记（通常是TPP⁺）或内在亲脂性/聚集诱导发射（AIE）机制实现。例如COUPY香豆素类化合物能在活细胞中优先积累于线粒体，并可通过可见光激活光敏剂[29]，体现了其作为线粒体靶向光化学工具的实用性。TPP⁺修饰的AIE活性香豆素（Cou-AIE-TPP⁺）实现了可靠的线粒体共定位，可用于神经元模型中的线粒体形态观察[30]。此外，近红外香豆素探针可用于检测线粒体中的超氧阴离子，并在细胞和小鼠中实现定量检测[32]；香豆素-花青素杂化物可作为同时靶向线粒体和其他细胞器的报告分子[33]。这些研究进一步强调了香豆素（及TPP⁺）作为多功能细胞器成像和探针设计的潜力。

在此框架下，我们设计了YBL-1，这是一种结合了线粒体靶向性和明亮荧光的香豆素-TPP⁺探针，适用于显微镜观察和信号检测。

材料

所有分析试剂均购自Sigma-Aldrich和Merck公司，使用前保持原始状态。所用金属盐包括：Hg²⁺（HgCl₂）、Ca²⁺（CaCl₂）、Mg²⁺（MgCl₂）、Zn²⁺（ZnCl₂）、Fe³⁺（FeNH₄(SO₄)₂·12H₂O）、Fe²⁺（Fe(NH₄)₂(SO₄)₂·6H₂O）、Cu²⁺（CuCl₂）和Ag⁺（AgCl）。除非另有说明，所有溶液均用HEPES缓冲液（pH 7.4）配制。

表征

¹H-和¹³C-NMR光谱使用Bruker 400 MHz多维光谱仪测定，以溶剂或TMS（三甲基硅烷）信号作为内标。

YBL-1的合成

YBL-1通过五步反应从1,3-二羟基苯合成：首先使用Vilsmeier-Haack反应对其进行甲酰化处理；随后通过Knoevenagel缩合反应生成化合物1；再将1与2-氨基-2-(羟甲基)丙烷-1,3-二醇（TRIS）缩合，得到化合物2；最后将2与7-羟基香豆素（2）反应，得到目标化合物YBL-1。

结论

YBL-1是一种紧凑且模块化的香豆素-三苯基磷鎓（TPP⁺荧光探针，集成了高水溶性、线粒体靶向性和选择性Fe³⁺响应特性。该探针在水中表现出稳定的光物理性质（Φ_F ≈ 0.76），对Fe³⁺具有明确的响应机制，且受常见二价阳离子干扰较小，便于直接进行荧光检测。

CRediT作者贡献声明

奥利姆波·加西亚-贝尔特兰（Olimpo García-Beltrán）：撰写、审稿与编辑、初稿撰写、验证、项目监督、方法学设计、资金申请、数据分析、概念构思。玛丽亚·基拉克奥（Maria Quilaqueo）：实验研究、方法学设计。奥斯瓦尔多·亚涅斯（Osvaldo Ya?ez）：撰写、审稿与编辑、初稿撰写、验证、方法学设计、实验研究、资金申请、数据管理、概念构思。卡米洛·塞古拉（Camilo Segura）：撰写、审稿与编辑、初稿撰写、验证、软件开发。

利益冲突

作者声明无利益冲突。

在研究过程中，作者使用了ChatGTP工具辅助论文英文润色。使用该工具后，作者对内容进行了必要的修改，并对发表文章的内容负全责。

资助

本研究由FONDECYT研究启动基金（项目编号11201141，授予P.J.U.）和CVTUCH基金（授予M.T.N.和O.G.-B.）资助。研究还得到了智利科学技术创新部（Ministerio de Ciencia, Tecnología y Innovación）、教育部（Ministerio de Educación）、工业贸易旅游部（Ministerio de Industria, Comercio y Turismo）以及ICETEX的支持，此外还获得了Francisco José de Caldas基金（项目编号RCFP44842-212-2018）的资助。部分研究经费还来自PROMETEO项目。

利益冲突声明

作者声明以下财务关系可能构成潜在的利益冲突：帕梅拉·乌鲁蒂亚（Pamela Urrutia）获得Fondecyt的资助；奥利姆波·加西亚-贝尔特兰（Olimpo García Beltran）获得Francisco José de Caldas基金的资助；拉蒙·马丁内斯（Ramon Martinez）获得瓦伦西亚自治区政府（Generalitat de Valencia）和MICIU AEI 10.13039 501100011033项目的资助。

致谢

我们感谢瓦伦西亚大学（Universitat de València）和瓦伦西亚理工大学（Universitat Politècnica de València）提供的实验室设施和质谱仪支持。同时感谢智利南部大学（Universidad Austral de Chile）的Igor Osorio教授在光致发光实验中的帮助，以及智利天主教大学（Pontificia Universidad Católica de Chile）提供的实验支持。