猪胰酶提取物、脂肪酶和α-淀粉酶中N-糖的结构、定量和功能特性分析

N-糖基化分析显示胰酶提取物（PPE）、胰脂肪酶（PPL）和胰α-淀粉酶（PPA）分别含有32、31和10种N-糖。唾液酸修饰占比PPE（25.6%）>PPL（29.3%）>PPA（10.9%），岩藻糖修饰在三者中均占主导（67.4%、66.9%、54.3%）。功能实验表明糖基化显著影响PPE和PPL活性，但对PPA影响较小。本研究首次系统解析了胰酶混合物的N-糖基化特征及其功能相关性。

　　

Moon Chulmin | Jung Chang Myeong | Park Chi Soo | Lee Han Seul | Kim Kyuran | Byeon Haeun | Eom Daeun | Kim Siwon | Lee Seojeong | Kim Ha Hyung

韩国忠安大学研究生院全球创新药物系，首尔东贾区Heukseok-ro 84号，邮编06974

摘要

猪胰酶提取物（PPE）是一种含有猪胰脂肪酶（PPL）、猪胰α-淀粉酶（PPA）和蛋白酶的酶混合物，能够促进脂肪、碳水化合物和蛋白质的消化，广泛用于治疗胰腺功能不全。N-糖基化是一种关键的翻译后修饰，对酶的稳定性和活性具有重要影响。本研究对PPE、PPL和PPA的N-糖链进行了分析，以评估它们在酶功能中的作用。通过酶法释放N-糖链，然后用普鲁卡因胺进行标记，并通过液相色谱-串联质谱法进行分析。每种N-糖链的相对含量以总N-糖链峰面积的百分比表示，总N-糖链的绝对含量（pmol）通过校准曲线计算得出。我们鉴定出32种（PPE）、31种（PPL）和10种（PPA）N-糖链，这些N-糖链具有不同的结构特征，包括唾液酸化和岩藻糖基化。PPE和PPL中的唾液酸化程度较高（分别为25.6%和29.3%），而岩藻糖基化分别出现在67.4%、66.9%和54.3%的糖链中。总N-糖链的绝对含量分别为：PPE 422 pmol/mg（1.01 pmol/总USP单位），PPL 602 pmol/mg（3.13 × 10^-2 pmol/pmol），PPA 131 pmol/mg（0.72 × 10^-2 pmol/pmol）。脱糖、去唾液酸化和去岩藻糖化后的功能测定表明，唾液酸化和岩藻糖基化对PPE和PPL的活性有影响，但对PPA的影响较小。这些结果表明，唾液酸化和岩藻糖基化对PPE和PPL的功能至关重要，而对PPA则影响较小。这是首次对PPE、PPL和PPA进行N-糖链分析的研究，证明了N-糖链在维持酶结构稳定性和调节酶活性方面的作用。

引言

猪胰酶提取物（PPE，EC 232-468-9）被广泛用作胰腺酶替代疗法（PERT），用于补充因外分泌胰腺功能不全、慢性胰腺炎和囊性纤维化等疾病导致的消化酶分泌不足而引起的营养吸收障碍[1]。PERT包含多种酶复合物，如猪胰酶提取物，其中含有猪胰脂肪酶（PPL，EC 3.1.1.3）和猪胰α-淀粉酶（PPA，EC 3.2.1.1）[2]。这些酶在消化脂肪、淀粉和蛋白质等大分子营养物质方面起着关键作用，从而促进营养物质的吸收和代谢[3]。研究表明，PPE有助于改善囊性纤维化和慢性胰腺炎患者的消化功能、预防消化不良并帮助体重管理[4] [5]。此外，患有与糖尿病相关的外分泌胰腺功能不全的患者使用PPE后也有改善[6]。PPL（分子量52 kDa）是PPE中的主要酶，负责在膳食脂肪吸收前将甘油三酯水解为二甘油酯、单甘油酯和游离脂肪酸[3] [7]。包括PPL在内的脂肪分解酶的一个显著特点是其在乳化底物存在下的活性增强[3]。PPL介导的水解过程包括三个关键步骤：界面吸附、界面激活和催化[8]。同样，PPA（分子量55 kDa）通过水解淀粉和麦芽糖分子中的α-(1,4)-糖苷键来促进多糖的消化[3] [9]。据报道，PPA可以与转铁蛋白、胎球蛋白和卵白蛋白等糖蛋白的N-糖链相互作用，结合到高甘露糖（Man）和混合型N-糖链上[10]。这些酶的活性和稳定性受多种因素影响，其中N-糖基化在调节酶功能、溶解度和抗降解性方面起着重要作用[11]。胰腺酶会经历多种翻译后修饰（PTMs），其中N-糖基化是决定酶稳定性、活性和抗降解性的关键因素[12] [13]。N-糖基化通常发生在Asn-X-Ser/Thr这一特定序列上，其中X可以是除Pro以外的任何氨基酸，Pro会抑制N-糖基化[13]。哺乳动物糖蛋白中的N-糖链由N-乙酰葡萄糖胺（GlcNAc）、甘露糖（Gal）、岩藻糖（Fuc）和唾液酸组成。N-糖链还可以根据N-糖链类型（高甘露糖型、混合型和复合型）以及存在的不同修饰（唾液酸化和岩藻糖基化）进行分类[14]。唾液酸主要存在于哺乳动物N-糖链的末端[15]。N-乙酰神经氨酸（Neu5Ac）是人类治疗性糖蛋白N-糖链末端的主要唾液酸形式[15]。N-羟基神经氨酸（Neu5Gc）不在人体内合成，但可以通过红肉等食物来源代谢获得[16]。唾液酸影响糖蛋白的化学、物理和免疫特性。唾液酸通过负电荷增加糖蛋白的稳定性，通过封闭末端Gal来保护血清糖蛋白免受降解[17] [18]。此外，唾液酸具有高度特异性的识别和结合能力，可与多种细胞受体相互作用，参与细胞-细胞、细胞-基质和分子识别[19]。岩藻糖基化包括N-糖链核心中的GlcNAc的岩藻糖基化和N-糖链末端的岩藻糖基化[20]。核心岩藻糖基化和末端岩藻糖基化影响N-糖链的柔韧性，并调节细胞生长、细胞信号传导和蛋白质-蛋白质相互作用[21] [22]。虽然PPE中的单个组分（如PPL和PPA）的生化特性已有所研究，但作为多酶混合物的PPE的全面N-糖基化分析仍然有限。目前使用DEAE（阴离子交换色谱）和SP-Sephadex（阳离子交换色谱）[24]、二维核磁共振（NMR）[25]以及气相色谱（GC）[26]对胰酶中的N-糖链进行了分析，但这些方法无法高灵敏度和高精度地对其结构进行详细定量分析。在本研究中，使用超高效液相色谱（UPLC）和液相色谱-电喷雾离子化（ESI）-高能量碰撞解离（HCD）-串联质谱（MS/MS）结合亲水相互作用液相色谱（HILIC）柱对PPE、PPL和PPA中的N-糖链进行了表征。首先，使用肽-N-糖苷酶F（PNGase F）酶法释放N-糖链，并用普鲁卡因胺（ProA）标记后进行UPLC总分析和绝对定量。然后，通过LC-ESI-HCD-MS/MS确定每种N-糖链的结构并计算其相对含量。此外，为了评估N-糖链的功能作用，还在去除N-糖链前后进行了酶活性测定。

材料

PPE（P7545）、PPL（L3126）、PPA（A6255）、二甲基亚砜（DMSO，276855）、微晶纤维素（C6288）、ProA（P9391）、氰硼氢化钠（156159）和三氟乙酸（TFA，302031）购自Sigma-Aldrich（美国密苏里州圣路易斯）。PNGase F（P0705L）购自New England Biolabs（美国马萨诸塞州伊普斯威奇）。石墨化碳柱购自Alltech（美国伊利诺伊州迪尔菲尔德）。乙腈（ACN）和乙醇购自Thermo Fisher Scientific（美国马萨诸塞州沃尔瑟姆）。

通过LC-ESI-HCD-MS/MS对N-糖链的结构表征

使用HILIC柱通过LC-ESI-HCD-MS/MS分析了PPE、PPL和PPA中的ProA标记的N-糖链。通过总离子色谱图（TIC，图1A–C）和氧onium离子的EIC（诊断性碎片离子，图1D–I和图S1A–F）鉴定N-糖链。主要诊断性氧onium离子[ProA-HexNAc₁ + H]⁺（理论m/z = 441.2708，图S1A–C）的EIC用于鉴定N-糖链。此外，[ProA-HexNAc₁Fuc₁ + H]⁺（理论m/z = 587.3281）的EIC也被用于鉴定。

结论

本研究获得了用ProA标记的PPE、PPL和PPA中的N-糖链，通过HILIC分离后，使用UPLC结合荧光检测和LC-ESI-HCD-MS/MS进行分析。UPLC色谱图显示了不同的N-糖链峰，揭示了N-糖链的特征。共鉴定出32种（PPE）、31种（PPL）和10种（PPA）N-糖链。根据其修饰（包括岩藻糖基化和唾液酸化）和类型对N-糖链进行了分类。

CRediT作者贡献声明

Lee Seojeong：研究工作。Kim Ha Hyung：写作、审稿与编辑、监督、概念构思。Moon Chulmin：写作、审稿与编辑、初稿撰写、研究、数据整理、概念构思。Kim Siwon：研究。Byeon Haeun：研究。Eom Daeun：研究。Jung Chang Myeong：写作、初稿撰写、研究、概念构思。Park Chi Soo：研究。Lee Han Seul：研究。Kim Kyuran：研究。

利益冲突声明

作者声明没有已知的财务利益或个人关系可能影响本研究报告的工作。

致谢

本研究得到了韩国国家研究基金会（NRF）基础科学研究计划的支持，该计划由教育部资助（项目编号2021R1A6A1A03044296）。本研究还得到了忠安大学2025年研究生研究奖学金的支持。