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本研究通过转录组和miRNA测序，对比野生、无症状及症状性太平洋金枪鱼的分子特征，发现癌症相关通路（如Wnt信号）和免疫失调（如miR-223）在症状性鱼中显著富集，无症状鱼亦呈现增殖基因特征，提示环境压力导致早期分子异常，为早期诊断提供依据。
Savanah L. Leidholt | Kalia Bistolas | Manoj Pastey | Mark Dasenko | Emily Miller | Alexander Norton | Kyle S. Van Houtan | Andre Boustany | Tatiana Galvin | Rebecca Vega Thurber
美国俄勒冈州科瓦利斯市俄勒冈州立大学
摘要
“肿胀鼻综合征”（Puffy Snout Syndrome, PSS）是一种在圈养鲭科鱼类中出现的、致死率较高的疾病，其特征是颅面组织过度增生和重塑。尽管该病在水产养殖中较为普遍，但其背后的分子机制仍不清楚。本研究通过对野生捕获的健康鱼、无症状圈养鱼以及有症状的圈养太平洋鲭鱼（Scomber japonicus）的面部组织进行mRNA和小RNA测序，以分析与该综合征相关的转录和转录后变化。主成分分析显示圈养鱼和野生鱼之间存在显著差异，其中有症状的鱼类表现出最明显的转录异常。共有2,293个基因的表达发生了变化，有症状的鱼类在癌症相关通路（如Wnt信号通路、细胞外基质-受体相互作用）和免疫过程（包括白细胞激活和MAPK信号通路）中表现出富集现象。无症状鱼类也显示出与癌症和增殖相关的基因特征，表明在出现可见病理变化之前，就已经发生了早期分子层面的改变。在有症状的鱼类中，关键的Wnt配体（wnt9b、wnt3a、wnt10a）表达上调，而免疫效应因子（ccl20a.4、perforin-1）表达下调，这表明同时存在增殖激活和免疫抑制现象。microRNA分析发现肿瘤抑制基因gmo-let-7h-2、免疫调节基因ola-miR-223以及应激响应基因tni-miR-212的表达存在差异，其预测靶点主要集中在细胞外基质组织、细胞因子信号传导和神经过程中。本研究首次提供了将肿瘤信号传导、免疫失调和细胞外基质重塑与PSS联系起来的转录组学和microRNA证据。在无症状鱼类中检测到类似癌症的分子特征，表明该病具有早期诊断和监测的潜力。这些发现为研究PSS的病因提供了分子框架，有助于生物标志物的开发，并强调了评估鲭科鱼类养殖环境中潜在环境和感染因素的必要性。
引言
目前，水产养殖满足了全球超过一半的海产品需求，这一趋势是由野生鱼类资源减少和消费量增加所推动的[1]。其中最具经济价值的鱼类包括鲭科鱼类（如金枪鱼、马鲛鱼和鲭鱼），2018年它们的产值达到了408亿美元[1]。尽管鲭科鱼类通常被认为具有较强的适应性，但圈养环境中的压力因素（如拥挤、饮食改变和水质波动）会损害它们的黏膜防御系统和免疫功能，从而增加患病风险。历史上，鲭科鱼类养殖中的疫情主要由寄生虫（如Cardicola属）以及细菌和病毒病原体（如Photobacterium damselae、Vibrio属和Tenacibaculum属）引起[2][3]。然而，并非所有死亡事件都能归因于已知的病原体，这提示可能存在新的或非传染性的疾病综合征。
“肿胀鼻综合征”（PSS）就是这样一种疾病，已成为导致鲭科鱼类及相关物种发病率和死亡率的主要原因之一。该综合征最早于20世纪50年代被描述，已在黄鳍金枪鱼（Thunnus albacares）、蓝鳍金枪鱼（T. thynnus, T. orientalis）、黑鳍金枪鱼（T. atlanticus）、鲣鱼（Katsuwonus pelamis）、鲭鱼（Scomber japonicus, S. scombrus）和太平洋马鲛鱼（Sarda chiliensis）中得到报道，同时也在北方鳀鱼（Engraulis mordax）、太平洋沙丁鱼（Sardinops sagax）和虹鳟鱼（Oncorhynchus mykiss）中观察到[4][5][6][7][8]。迄今为止，PSS仅限于圈养环境中的鱼类，通常在饲养后六个月内发病[7]。临床上，该病表现为面部色素沉着，随后出现胶状组织增生，在严重情况下会妨碍进食或视线，最终导致安乐死或饿死。对22个养殖场的调查显示，超过三分之二的养殖场出现了PSS，死亡率在20%到100%之间[7]。组织病理学检查发现肌肉被胶原纤维替代，杯状细胞丢失，线粒体退化[7][8]。这些病变与其他脊椎动物的纤维增生或肿瘤样综合征相似[9][10][11]。
PSS的病因尚未明确。虽然在受影响组织中观察到了类似病毒的颗粒（VLPs），但尚未分离出一致的病原体，而且无症状个体中也存在这些颗粒[8]。其他可能的解释包括肿瘤形成、慢性免疫失调或环境因素引起的组织重塑。已知逆转录病毒和疱疹病毒能够诱导鱼类肿瘤[12][13]。纤维增生综合征还与圈养鱼类的慢性压力、内分泌紊乱和微生物群失衡有关[14][15][16]。由于PSS仅发生在圈养环境中且缺乏明确的致病因子，因此很可能是环境压力、免疫功能障碍和异常组织重塑共同作用的结果。然而，目前仅有的一项同行评审研究通过电子显微镜观察到了类似病毒的颗粒和细胞器损伤[8]，尚未进行转录组学或microRNA分析，因此在机制理解方面存在重大空白，限制了诊断方法的发展。
本研究旨在利用高通量mRNA和小RNA测序技术，对易受样本采集影响的太平洋鲭鱼（Scomber japonicus）的PSS分子基础进行探究。我们比较了野生鱼、无症状圈养鱼和有症状圈养鱼的转录组和microRNA表达谱，具体目标包括：（1）识别与组织重塑、纤维化和增殖相关的差异基因表达；（2）分析不同表型和圈养状态下的microRNA表达模式；（3）区分感染性、肿瘤性或环境因素引起的病因特征。通过整合mRNA和microRNA数据，本研究为PSS的发病机制提供了新的见解，并评估该病是否属于肿瘤样综合征、慢性免疫激活或圈养引起的组织紊乱。
样本采集与伦理
圈养和野生捕获的太平洋鲭鱼的样本采集及安乐死操作按照先前的方法进行[8]。圈养的太平洋鲭鱼（Scomber japonicus）在蒙特雷湾水族馆中按照Miller等人（2021年）描述的养殖条件进行饲养。简而言之，这些鱼被安置在一个直接从蒙特雷湾引入的海水循环系统中，定期监测水质参数（包括氮废物化合物等）。
结果
本研究采用标准比较转录组学方法及microRNA分析，研究了包括野生鱼和有（有症状）或无（无症状）PSS症状的圈养鱼在内的太平洋鲭鱼的生理变化（图1A）。所有野生捕获的鲭鱼均被假定为健康状态，因为它们在外部和内部均无明显的疾病迹象。比较转录组学分析显示基因表达存在明显的分组。
圈养环境会导致PSS病变前的广泛转录变化
本研究首次对太平洋鲭鱼的“肿胀鼻综合征”（PSS）进行了转录组学分析，也是该病第二项经过同行评审的研究，发现了与颅面肿瘤发生和免疫功能障碍相关的分子特征。受损组织中癌症相关通路的富集以及免疫失调表明，该病的病因可能涉及肿瘤形成和感染因素。
CRediT作者声明
Savanah L. Leidholt：概念提出、方法设计、数据分析、可视化处理、初稿撰写、审稿与编辑。
Kalia Bistolas：方法设计、实验实施、数据分析、审稿与编辑。
Manoj Pastey：研究监督、资源协调、审稿与编辑。
Mark Dasenko：方法设计、资源协调、数据管理。
Emily Miller：概念提出、资源准备、实验实施、审稿与编辑。
Alexander Norton：资源支持。
致谢
本研究的顺利完成得益于蒙特雷湾水族馆的慷慨支持。我们特别感谢MBA养殖运营团队和MBA动物护理团队的S. Greenwald、J. O'Sullivan、J.M. Ezcurra、H. Fenix、J. Welch、L. SanAhmadi、H. Jariwala、D. Hernandez、E. Lenihan、M. Young、M. Murray等人的技术和后勤支持。
