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本研究探讨5-ALA对两种壳色太平洋牡蛎壳色素沉积和先天免疫的影响，发现橙色壳牡蛎优先通过PPIX沉积增强颜色，而金色壳则通过血红素合成激活Nrf2、TLR4、MyD88和IL-17等免疫基因，并伴随抗氧化酶活性提升和脂质过氧化减少。5-ALA通过调控CgPPOX表观遗传和CgTspO/CgABCG2转运蛋白表达，建立色素代谢与免疫的新关联，最佳剂量为20 mg/L。
Biyang Hu | Hong Yu | Chengxun Xu | Lingfeng Kong | Shikai Liu | Shaojun Du | Qi Li
中国海洋大学教育部海洋养殖重点实验室，青岛市266003
摘要
壳色是海洋软体动物的关键市场特征，而抗逆性对于集约化水产养殖至关重要。本研究探讨了饮食中5-氨基乙酰丙酸（5-ALA；浓度为0、10、20和40 mg/L）对两种太平洋牡蛎Crassostrea gigas壳色品系壳色素沉着和先天免疫力的90天影响。结果揭示了不同的原卟啉IX（PPIX）利用策略：橙壳品系优先将PPIX用于壳沉积，从而增强颜色；相比之下，金壳品系将PPIX重新定向用于血红素合成，随后激活了全身防御反应。在金壳C. gigas中，这种反应包括与免疫相关的基因（如核因子红系2相关因子2（Nrf2）、Toll样受体4（TLR4）、髓系分化初级反应88（MyD88）和白细胞介素-17（IL-17）的显著上调。同时，抗氧化酶超氧化物歧化酶（SOD）和过氧化氢酶（CAT）的活性增加，谷胱甘肽（GSH）水平升高，脂质过氧化（丙二醛，MDA）减少。此外，5-ALA还诱导了CgPPOX的低甲基化，并调节了PPIX转运蛋白（CgTspO、CgABCG2）的表达，建立了卟啉代谢与免疫力之间的新联系。确定20 mg/L的5-ALA为最佳剂量，该剂量同时改善了理想的壳色特征和生理抗逆性。本研究为颜色特征的分子基础提供了新的见解，并为理解水生动物中色素代谢与免疫功能之间的机制提供了理论基础。
引言
外源性饲料添加剂在水产养殖中广泛用于改善关键经济性状。其中，基于色素的添加剂对于提高具有经济价值的水生物种的色型特别有价值[1]、[2]。5-氨基乙酰丙酸（5-ALA）是一种内源性非蛋白质氨基酸，是卟啉生物合成的通用前体[3]，为对生物体着色至关重要的色素提供了代谢基础[4]、[5]、[6]。除了在色素沉着中的作用外，新兴证据表明5-ALA可以通过上调抗氧化酶和免疫相关基因[7]、[8]、[9]来增强非特异性免疫力，并调节包括能量代谢和肠道健康在内的更广泛的生理过程[10]。这些观察结果表明，5-ALA可能通过其在氧化还原调节和色素合成中的双重功能同时改善生理抗逆性和色型。
卟啉代谢途径中，5-ALA作为初始前体[11]，涉及一系列酶促步骤：原卟啉原氧化酶（PPOX）生成原卟啉IX（PPIX），然后铁螯合酶（FECH）催化铁的插入形成血红素[12]、[13]。卟啉显著影响壳结构和颜色[4]、[6]、[14]、[15]，其中PPIX对橙色、棕色及相关壳色尤为重要[16]、[17]、[18]、[19]、[20]。这种代谢途径在形成壳的生物体中受到多个层次的调控：最初的卟啉合成受氨基乙酰丙酸合成酶（ALAS）基因表达的控制[18]、[21]、[22]、[23]、[24]，而PPOX和FECH的DNA甲基化可以进一步调节酶活性并影响壳色[25]。这些调控机制与转运蛋白（如转运蛋白TspO）和ATP结合盒亚家族G成员2（ABCG2）[26]、[27]的活性相结合，共同决定了PPIX的空间分布，从而塑造了水生动物的色素沉着[19]、[20]。值得注意的是，卟啉途径还与氧化应激反应相互作用。从PPIX衍生的血红素可以诱导血红素加氧酶-1产生胆红素，这是一种强效的活性氧（ROS）清除剂[28]。在太平洋白虾（Litopenaeus vannamei）中，饮食中的5-ALA已被证明可以增加抗氧化酶（如超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）和谷胱甘肽过氧化物酶的活性，同时减少脂质过氧化标志物（如丙二醛（MDA）[7]。这些发现表明5-ALA是一种有前景的双重用途补充剂，在水产养殖中既能改善商业性状又能提高抗逆性。然而，表观遗传调控、PPIX转运及其产生的生理效应之间的相互作用仍不甚明了。
太平洋牡蛎（Crassostrea gigas）在全球水产养殖中具有重要的经济价值[29]，其中壳色是一个关键的市场性特征。消费者偏好通常受视觉吸引力的影响，特定颜色与质量或稀有性相关[30]。除了直接的消费者认知外，壳色多态性也是选择性育种计划中的有价值表型标志。开发出稳定的、视觉上独特的品系（如具有基于卟啉的颜色多态性的橙壳和金壳牡蛎[19]、[20]），旨在提高产品差异化和消费者吸引力[31]、[32]。此外，由于色素沉积受生理因素影响，壳色也可能作为健康状况的生物标志物，从而增加了其在农场管理中的实际价值[30]。与其他无脊椎动物一样，牡蛎依赖于包括Toll样受体（TLRs）在内的先天免疫系统以及下游信号分子（如髓系分化初级反应88（MyD88）和核因子κ-B（NF-κB），这些分子调节细胞因子（包括白细胞介素-17（IL-17））的产生[33]、[34]。同时，管理氧化应激在牡蛎养殖中至关重要，因为它是C. gigas死亡的主要原因[35]。牡蛎的滤食行为使其能够有效吸收溶解的营养物质，研究表明酪氨酸和半胱氨酸等饮食前体可以影响黑色素合成和壳色素沉着[36]、[37]。虽然已知不同壳色品系之间的卟啉分布存在差异，但利用5-ALA等卟啉前体同时调节色素沉着和激活综合免疫-抗氧化反应的潜力尚未被探索。目前尚不清楚5-ALA是否能够同时增强观赏性状和生理抗逆性。
本研究旨在阐明5-ALA在两种选择性培育的C. gigas壳色品系中调节壳色素沉着和免疫-抗氧化反应的双重作用。通过表型特征、PPIX代谢、表观遗传调控和转录组分析的整合研究，试图阐明不同的PPIX代谢策略如何驱动壳色多态性和抗氧化或免疫能力的差异。这些发现为卟啉代谢与海洋双壳类动物先天免疫力之间的联系提供了新的见解，为开发提高经济性状和疾病抵抗力的营养策略提供了理论基础。
样本收集和实验设计
实验材料包括橙壳品系（高PPIX含量）和金壳品系（低PPIX含量）的C. gigas，通过六代选择性育种在中国山东省荣城市获得，时间为2024年5月。在喂食试验之前，牡蛎在实验室进行了10天的适应期，每天喂食两次Chlorella vulgaris。喂食试验中，共有240只牡蛎被安置在8个水箱中（每个水箱30只个体）
5-ALA补充后C. gigas的壳色变化
在添加梯度5-ALA的饲养条件下90天后，实验组和对照组C. gigas都形成了新的可观察到的壳（图S2和S3）。在90天期间，两种品系的生长参数（包括壳长度、高度、宽度和湿重）与其各自的对照组之间没有显著差异，详细数据见补充表S4。对新沉积壳的颜色进行了CIELAB分析
品系特异性的卟啉代谢决定了5-ALA诱导的表型差异
C. gigas品系之间对5-ALA的不同壳色和生理反应源于不同的卟啉代谢策略，这些策略受表观遗传调控和关键转运蛋白的不同活性控制。在橙壳C. gigas中，外层外套膜褶中的CgPPOX持续低甲基化促进了高PPIX的产生，PPIX主要通过CgTspO高效输出并沉积到壳基质中，导致明显的色素沉着。相比之下，
结论
本研究表明，饮食中的5-ALA通过调节卟啉代谢在太平洋牡蛎中诱导了品系特异性的反应。在橙壳C. gigas中，5-ALA主要通过PPIX的积累和沉积来增强壳色素沉着，这一过程得益于允许的表观遗传状态和转运蛋白活性。在金壳C. gigas中，5-ALA促进了PPIX向血红素合成的代谢重定向。积累的血红素随后作为关键信号分子发挥作用
动物伦理声明
该动物研究已由中国海洋大学审核并批准。在本研究中，所有动物实验均符合ARRIVE指南。
CRediT声明
Biyang Hu：数据管理；调查；方法学；可视化；撰写 - 原初草稿
Hong Yu：监督
Chengxun Xu：监督
Lingfeng Kong：监督
Shikai Liu：监督
Shaojun Du：监督
Qi Li：项目管理；监督；撰写 - 审阅与编辑
致谢
本研究得到了国家自然科学基金（32373115）、青岛蓝种业创新项目（QDLYY-2024001）、泰山产业专家计划以及广东省现代海洋牧场候选物种育种技术研究（2024-MRB-00-001）的资助。
