《Food Bioscience》：Rapid colloidal gold immunochromatography assay platform for detection of alkaline phosphatase in milk
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单克隆抗体介导的胶体金试纸条快速检测法成功建立，检测限低至1.17 ng/mL，可在12分钟内区分生牛奶与巴氏杀菌奶，特异性克服常见乳蛋白交叉反应问题。
周炳杰|徐欣欣|宋珊珊|孙茂忠|黄华|徐传来|郭玲玲
江南大学食品科学与资源国家重点实验室，中国江苏省无锡市，214122
摘要
牛奶中的碱性磷酸酶（ALP）是评估巴氏杀菌效果的重要指标。为确保食品安全，迫切需要开发快速准确的检测牛奶中ALP的方法。在本研究中，筛选出了对ALP具有高灵敏度和特异性的单克隆抗体。牛奶中ALP的检测限为1.17 ng/mL，检测范围为2.39–238.17 ng/mL。随后，基于这些单克隆抗体开发了一种侧向流动免疫测定（LFIA）平台，可在12分钟内提供检测结果。该LFIA试纸条能够有效识别和定量牛奶中的ALP，且不会与其他常见牛奶蛋白质发生交叉反应。此外，该试纸条还能准确区分生牛奶和巴氏杀菌牛奶。这种LFIA平台成本低廉且检测速度快，具有显著的市场潜力。
引言
碱性磷酸酶（ALP）是一种含锌的糖蛋白酶，在哺乳动物的体液和组织中广泛存在[1]。ALP的分子量为187 kDa，等电点在5.4到6.0之间。其主要功能是在细胞代谢和信号传导过程中水解磷酸盐和焦磷酸盐，推动多种生理和生化过程[2]。此外，ALP的含量也是评估牛奶热处理强度的关键指标。研究表明，ALP在56°C下加热30分钟会发生热变性[3, 4]。值得注意的是，ALP的热稳定性略高于牛奶中的大多数病原微生物，如结核分枝杆菌和单核细胞增生李斯特菌。充分的热处理不仅可以灭活细菌，还能使ALP失活[5, 6]。微生物生长过程中产生的ALP常常会影响检测结果的准确性，导致假阳性。微生物来源的ALP通常比牛奶来源的ALP具有更高的热稳定性。例如，对巴氏杀菌敏感的嗜冷细菌可以产生耐热的ALP。当生牛奶中的微生物数量较多时，即使经过充分巴氏杀菌，仍可能因这些微生物来源的ALP而检测出阳性[7]。因此，特异性测定牛奶中的ALP水平对于评估巴氏杀菌效果至关重要。目前有多种方法可用于测定ALP水平，包括免疫测定、化学比色法[8, 9]、苯丙氨酸抑制技术[10]、化学发光法[11]和电化学法[12]、凝集素沉淀法[13]。其中，免疫测定、化学比色法和化学发光法常用于ALP的检测。化学比色法操作简便，但灵敏度较低且特异性较差。化学发光法利用荧光强度作为ALP的定量检测信号，可实现高灵敏度的检测。Lin等人[14]建立了一种比率荧光传感技术，能够检测低至0.01 mU/L的ALP活性。然而，该技术需要专用设备，仅适用于实验室分析[15]。特异性抗原-抗体反应赋予免疫学方法高特异性、高灵敏度和重复性[16, 17]。此外，免疫测定能够有效区分牛奶中不同来源的ALP，而其他方法则无法实现这一点[6, 18]。有一种间接ELISA方法用于检测生牛奶中的ALP含量[19]。由于抗体的特异性，该方法可以区分微生物来源和牛奶来源的ALP，并准确识别阳性样本。不过，该方法在准确性和时间消耗方面仍存在局限性。快速、特异性的ALP检测方法有助于消费者及时了解牛奶的杀菌程度。现有的牛奶ALP检测方法要么依赖实验室处理，要么缺乏特异性。因此，亟需一种方便、快速、易于操作且特异性的检测方法。
随着快速检测技术的发展，侧向流动免疫测定（LFIA）试纸条已在即时检测中得到广泛应用，其优点包括操作简单、方便快捷且价格相对较低[20, 21, 22, 23]。刘等人[24]开发了一种荧光微球免疫层析法，可在15分钟内检测骨ALP含量。LFIA方法结合了免疫反应和层析技术，无需专业培训人员即可进行即时检测[25]。具有高特异性和快速性的LFIA平台是检测牛奶中ALP的有效手段。
在本研究中，通过皮下注射使小鼠免疫ALP，随后利用杂交瘤技术制备了针对ALP的单克隆抗体（mAbs）。接着建立了双抗体夹心ELISA方法以筛选最佳配对抗体。此外，还开发了一种基于抗ALP mAbs的胶体金免疫层析生物传感器，以实现高灵敏度的ALP检测。
材料与试剂
ALP标准品购自Sigma-Aldrich（中国上海）。完整的弗氏佐剂、不完全弗氏佐剂、辣根过氧化物酶（HRP）、四甲基联苯胺（TMB）和聚乙二醇1450也购自Sigma-Aldrich（中国上海）。杂交瘤细胞制备所需的所有试剂，包括RPMI 1640细胞培养基、胎牛血清、胰蛋白酶、HT补充剂和HAT补充剂，均购自Gibco（中国上海）。成对分析
细胞融合和亚克隆后共选择了15个细胞簇。HRP-mAb结合物的滴度见图2a。所有标记的抗体在1、0.3和0.1 μg/mL的浓度下均能有效识别ALP，证实了标记成功。值得注意的是，与其他mAbs相比，15D5和16E2的滴度较高，表明它们对ALP的亲和力更强。随后进行了系统的最佳捕获和检测抗体配对筛选。结论
经过小鼠免疫和细胞融合后，成功筛选出了15株分泌高灵敏度ALP单克隆抗体的杂交瘤细胞系。使用mAb 15D5和16E2建立了双抗体夹心ELISA方法。PBS中ALP的检测限为0.63 ng/mL，牛奶中的检测限为1.17 ng/mL。此外，还建立了一个LFIA平台用于实际样品检测。结果表明，LFIA试纸条可在12分钟内定量分析牛奶中的ALP。作者贡献声明
郭玲玲：撰写、审稿与编辑，资金申请。
徐传来：数据可视化，项目管理。
黄华：监督，概念设计。
孙茂忠：验证，方法学研究。
宋珊珊：资源协调，实验实施。
徐欣欣：资源支持，数据分析。
周炳杰：撰写初稿，数据整理
数据获取
本研究生成和分析的数据集可应要求向通讯作者索取。利益冲突
作者未报告任何潜在的利益冲突。伦理标准遵守情况
本文未涉及人类受试者的研究。所有动物实验均在江南大学动物福利委员会的指导下进行。资助
本工作得到了国家重点研发计划（编号22404066、22476067、22274067和22236002）的资助。利益冲突声明
作者声明没有已知的财务利益冲突或个人关系可能影响本文的研究结果。
