《Food Research International》：Ultrasound-mediated inactivation of polyphenol oxidase and peroxidase: Mechanisms involving enzyme structural disruption and catalytic activity alteration
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超声灭活多酚氧化酶（PPO）和过氧化酶（POD）的研究：低温超声通过功率与温度协同作用破坏酶次级结构（α-螺旋减少60.93%-49.33%）、活性位点嵌入/断裂，并降低催化效率（PPO↓98.94%，POD↓66.52%）及结合能（PPO↓46.37%，POD↓17.90%），实现高效低成本酶灭活。
曲文娟|阮文艳|刘颖|周存山|马海雷
江苏大学食品与生物工程学院，中国江苏省镇江市学府路301号，212013
摘要
为了提高酶失活效率并降低成本，本研究开发了一种创新的低温超声波失活方法。研究了超声波参数对酶活性、结构和催化性能的影响。通过分子模拟阐明了超声波失活的潜在机制。结果表明，超声波显著降低了酶活性，PPO在60°C、300 W、90分钟条件下的失活率为100%，POD在60°C、300 W、120分钟条件下的失活率为95.18%。酶失活是由于结构破坏和酶-底物相互作用减弱所致，这与超声波功率和温度效应有关。PPO和POD的主要变化包括：二级结构破坏（α-螺旋减少60.93%、49.33%），活性位点断裂或嵌入，催化效率降低（分别降低98.94%、66.52%），以及结合能降低（分别降低46.37%、17.90%）。本研究提供了关于低温超声波使PPO和POD失活的全面机制理解，强调了超声波作为传统高温方法的有希望的替代方案。
引言
多酚氧化酶（PPO）和过氧化物酶（POD）是两种广泛存在于植物组织中的关键酶，在食品加工中起着重要作用。PPO催化酚类化合物氧化成醌类物质，这些醌类物质随后聚合形成棕色色素。这种酶促褐变会影响食品的颜色、风味和整体质量（Xu等人，2022年）。POD会促进氧化变质，对食品的营养价值和感官特性产生负面影响（Shen等人，2023年）。因此，有效失活PPO和POD对于提高食品质量至关重要。传统的酶失活方法包括高温处理、化学抑制剂和高压处理。尽管高温处理可以有效失活PPO和POD，但往往会导致热敏营养素的降解和较高的能耗（Zhou等人，2024年）。化学抑制剂在较低温度下虽然有效，但可能会留下潜在的食品安全风险（Zhou等人，2020年）。高压处理虽然高效，但由于设备成本高昂，限制了其大规模工业应用（Engmann等人，2020年）。因此，迫切需要开发高效、经济且安全的酶失活策略来保持食品质量。
近年来，由于其处理时间短、能耗低和操作简便等优点，超声波技术已成为食品工业中一种有前景的物理处理技术（Guo、Wu、Lu等人，2021年）。例如，Schuina等人（2021年）研究表明，在60°C下进行40 kHz、10分钟的超声波处理可以使果胶甲酯酶（PME）失活83.5%，而不会改变橙汁的可溶性固形物含量、pH值和颜色。相比之下，90°C的巴氏杀菌虽然能有效失活酶，但会导致产品的感官和营养品质下降。这些发现突显了超声波相对于传统高温方法的优势，即在较低温度下实现类似的失活效率，同时更好地保持了营养特性。此外，超声波的可扩展性和与连续处理系统的兼容性使其适用于工业应用。
多项研究表明，超声波通过处理过程中产生的空化效应和机械剪切力来失活酶（Rathnakumar等人，2023年）。空化作用会产生局部高温和高压，破坏酶的活性位点并抑制酶活性。此外，机械剪切可能会改变酶的结构，进一步降低其功能。Nasiru等人（2022年）使用圆二色光谱（CD）发现，超声波使溶菌酶从α-螺旋结构转变为β-折叠结构，这与酶活性降低密切相关。Zhang等人（2023年）观察到扫频超声波增加了血管紧张素转换酶（ACE）的表面疏水性，从而影响了其活性。尽管这些研究加深了我们对超声波辅助酶失活的理解，但效率可能因酶结构的不同而有所差异。基于这些发现，本研究提出了一个核心假设：低强度超声波处理可以有效地破坏PPO和POD的空间结构，从而在低于传统高温处理温度的情况下降低其催化功能。这种破坏是由于超声波独特的空化和剪切效应造成的，从而实现了低能耗下的高效酶失活。然而，超声波对PPO和POD失活的具体作用及其背后的定量机制仍不够明确。需要一项综合研究，整合分子动力学（MD）模拟、分子对接和各种光谱技术，以量化超声波参数对PPO和POD结构以及酶-底物相互作用的影响。
本研究旨在开发一种创新的低温超声波方法，作为传统酶变性技术的有效且经济高效的替代方案，用于PPO和POD的失活。该研究创新地评估了超声波处理对酶失活、构象结构和底物结合能力的影响。此外，还试图阐明超声波诱导PPO和POD失活的机制，并量化温度和超声波功率对这些影响的相对贡献。
材料与试剂
酪氨酸酶（>500 U/mg）和过氧化物酶（>300 U/mg）购自Macklin生化技术有限公司（中国上海）。1-苯胺-8-萘磺酸（ANS）、儿茶酚（99.5%）和愈创木酚（>99.0%）购自中国药科大学试剂有限公司（上海）。所有其他化学试剂均为分析级。
超声波处理
为了评估超声波对PPO和POD活性的影响，准备了标准酶溶液（0.05 mg/mL，溶解在pH 6.8的磷酸盐缓冲液中；PPO：
超声波温度和功率对酶活性的影响
图1A显示，在30°C、50°C和60°C的温度条件下，超声波功率为300 W时，PPO和POD的残余活性随暴露时间的增加而显著降低（p < 0.05）。PPO在30°C和50°C下120分钟时的失活率分别为82.59%和92.92%，而在60°C下30分钟时为96.25%，50分钟时为98.44%，90分钟时为100%。POD在30°C、50°C和60°C下的失活率分别为6.59%、49.92%和95.18%。
结论
本研究证明，特定的超声波温度、功率和处理时间可以有效失活PPO和POD，分别在60°C-300 W、90分钟和60°C-300 W、120分钟条件下达到100.00%和95.18%的失活率。这些结果归因于温度和功率处理造成的显著结构损伤以及酶-底物相互作用的减弱。
作者贡献声明
曲文娟：撰写 – 审稿与编辑、项目管理、研究实施、资金获取、概念构思。阮文艳：撰写 – 初稿撰写、方法学设计、数据分析。刘颖：撰写 – 初稿撰写、方法学设计、数据分析。周存山：撰写 – 审稿与编辑、数据可视化。马海雷：撰写 – 审稿与编辑、数据可视化。
未引用参考文献
Wahia等人，2019年
利益冲突声明
作者声明没有已知的利益冲突或个人关系可能影响本文所述的工作。
致谢
作者感谢江苏省现代农业机械装备和技术推广项目（NJ2025-06）的支持。
