非酿酒酵母发酵剂能够调节由巴西可可混合原料制成的巧克力的化学成分和感官特性

《Food Research International》：Non- Saccharomyces starter cultures modulate the chemical and sensory profile of chocolates from Brazilian cocoa hybrid mixtures

可可混合杂交种发酵中Hanseniaspora uvarum和Pichia kluyveri接种的微生物调控及品质优化研究。通过qPCR、HPLC/GC-MS和感官测试，发现H. uvarum增强氨基酸和甲基黄嘌呤代谢，P. kluyveri促进醇酯生成，提升巧克力接受度。

　　

Sandy Rodrigues Dias | Luiza Adami | Nádia Nara Batista | Ana Paula Pereira Bressani | Silvia Juliana Martinez | Disney Ribeiro Dias | Rosane Freitas Schwan

巴西米纳斯吉拉斯州拉夫拉斯联邦大学食品科学系，邮编37203-202

摘要

已有研究探讨了使用单一可可杂交品种进行接种的方法。然而，使用杂交品种混合物进行发酵时引入发酵剂的研究尚未深入。因此，本研究探讨了接种Pichia kluyveri CCMA0237 (Pk)和Hanseniaspora uvarum CCMA0236 (Hu)对可可杂交品种混合物发酵的影响，重点关注其化学成分和感官特性的变化。通过qPCR监测微生物组成；利用HPLC、LC/MS和GC/MS分析化学成分的变化；并根据CATA评估方法进行感官属性分析。结果表明，Hu菌株的菌群密度较高。碳水化合物在发酵过程中被代谢，生成有机酸、醇类和挥发性化合物，其中乙酸含量最高。Hu菌株产生的游离氨基酸水平也较高，尤其是甘氨酸和缬氨酸。在干燥结束时，Pk菌株的可可碱和咖啡因含量较低。共鉴定出126种挥发性化合物，其中2-壬醇和苯乙基醇是发酵过程中的主要成分。Pk菌株在干燥结束时增加了醇类和酯类的含量，从而提高了巧克力的整体品质。而Hu菌株发酵的巧克力则表现出更强的苦味和甜味。对照组的挥发性化合物含量在干燥过程和最终成品中均较低。接种Pk和Hu菌株能够调节可可杂交品种的发酵过程。

引言

在巴西，栽培的可可杂交品种种类繁多，这些品种在果实颜色和大小、种子大小以及果肉和可可脂的化学成分方面存在差异，包括碳水化合物、有机酸、甲基黄嘌呤、多酚和氨基酸浓度的不同。这些因素会影响发酵过程中的微生物动态，并进而影响巧克力的质量（Dias等人，2025；Martinez等人，2021；Moreira等人，2018；Moretti等人，2023；Ramos等人，2014；Silveira等人，2023）。为了确保发酵成功，可可生产商通常会在同一批次中混合使用多种杂交品种，以平衡碳水化合物含量并提升发酵效果和巧克力品质（Dias等人，2025；Martinez等人，2021）。 在埃斯皮里图桑托州的林哈雷斯地区，当地生产商常将PH 16、PS 1319、BN 34、SJ02、CEPEC 2002、Ipiranga和CCN 10等杂交品种混合使用，这反映了巴西可可种植园的遗传多样性（Dias等人，2025；Galeano等人，2022）。Dias等人（2025）研究了这种混合品种的发酵过程，发现Hanseniaspora uvarum、Hanseniaspora opuntiae、Pichia manshurica和Saccharomyces属酵母是发酵过程中的主要菌株。这些菌株与2-壬醇的高浓度相关，且由此生产的巧克力具有明显的可可风味和酸味。 可可发酵作为一种自发的农场内过程，其机制主要由复杂的微生物群落驱动，主要包括酵母、乳酸菌（LAB）和醋酸菌（AAB）（De Vuyst & Leroy，2020；Schwan等人，2014）。在这些微生物中，酵母在发酵初期起着关键作用，它们的生长和代谢活动对形成巧克力的风味和香气至关重要。如S. cerevisiae、P. kluyveri、H. uvarum、H. opuntiae、Torulaspora delbrueckii和Kluyveromyces marxianus等菌株在发酵过程中频繁被提及，并被认为是潜在的发酵剂候选菌株（Batista等人，2015a, 2015b；Coria-Hinojosa等人，2024；De Vuyst & Leroy，2020；Dias等人，2025；Díaz-Mu?oz等人，2023；Ramos等人，2014；Visintin等人，2017）。其中，H. uvarum和P. kluyverer菌株能够产生分解可可果肉中果胶的酶，从而促进有机酸、氨基酸、高级醇类和酯类的生成，这些化合物构成了巧克力复杂的风味和香气成分（Batista等人，2016；Ramos等人，2015；Coria-Hinojosa等人，2024）。 在可可发酵过程中释放的游离氨基酸（如丙氨酸、甘氨酸、丝氨酸、谷氨酸、精氨酸和酪氨酸等）对巧克力的风味和香气至关重要，它们赋予巧克力鲜味、甜味和苦味等特性（Balcázar-Zumaeta等人，2024；Chang等人，2025）。 鉴于调节巧克力化学成分对品质的重要性，人们已使用发酵剂来改进和标准化发酵过程。尽管对可可发酵中发酵剂的理解有所进展，但这是首次将发酵剂应用于可可杂交品种混合物的发酵研究。大多数研究集中在单一可可品种的发酵或受控实验条件下进行，这些情况并不能反映实际的生产情况。发酵剂可以减少混合品种间的化学差异，从而改善发酵过程中的微生物动态、代谢产物的形成以及感官一致性。因此，本研究旨在评估接种H. uvarum CCMA0236和P. kluyveri CCMA0237对可可杂交品种（PH 16、PS 1319、BN 34、SJ02、CEPEC 2002、Ipiranga和CCN 10）发酵过程的影响，以减轻混合物的固有变异性，提高批次间的均匀性和生化预测性。

微生物

P. kluyveri CCMA0237和H. uvarum CCMA0236酵母来自巴西米纳斯吉拉斯州拉夫拉斯联邦大学的农业微生物菌种保藏库（CCMA）。这两种酵母均是从可可发酵过程中分离得到的（Moreira等人，2013）。随后按照Martins等人（2023）的方法对酵母进行了重新激活和培养。接着，将酵母细胞在3852 RCF条件下离心10分钟，达到7 log₁₀细胞·mL^?1的浓度，然后进行储存。

温度变化及通过qPCR监测发酵剂

在整个发酵过程中，温度范围为24.5至46.3°C（见补充材料图S1）。Ch组的最高温度为46.3°C，出现在64小时时；Hu组的最高温度为44.9°C，同样出现在64小时时；Pk组的最高温度为44.7°C，出现在72小时时。发酵期间的环境温度为22至25°C。 在发酵过程中，成功检测并定量了P. kluyveri和H. uvarum酵母的数量。

讨论

H. uvarum CCMA0236和P. kluyveri CCMA0237的代谢活动改变了微生物生态平衡，调整了代谢途径，并影响了可可发酵过程中的化学变化，进而影响了烘焙和巧克力生产过程中的风味和香气。H. uvarum菌株的种群稳定性优于P. kluyveri菌株。

结论

本研究提供了有力证据，表明使用非Saccharomyces属的P. kluyveri CCMA0237和H. uvarum CCMA0236酵母进行控制性接种可以调节混合可可品种发酵过程中的微生物生态、代谢流和化学转化路径。H. uvarum菌株在整个发酵过程中的竞争优势和持久性表明其在可可果肉环境中的适应性更强。

作者贡献声明

Sandy Rodrigues Dias：撰写初稿、验证、方法学设计、实验设计、数据分析、概念构建。 Luiza Adami：方法学设计、概念构建。 Nádia Nara Batista：撰写初稿、数据可视化、结果验证、实验监督、数据分析、概念构建。 Ana Paula Pereira Bressani：撰写初稿、数据可视化、结果验证、资源协调、方法学设计、实验设计、数据分析、概念构建。

资金来源 本项目得到了巴西高等教育人员培训协调委员会（CAPES）、国家科学技术发展委员会（CNPq）和米纳斯吉拉斯州研究支持基金会（FAPEMIG）的支持。

未引用参考文献 Contarino等人，2019 Mapa，2022

利益冲突声明 作者声明没有已知的可能影响本文研究的财务利益或个人关系。

致谢 作者衷心感谢S?o Luiz Farm、Chocolates Espírito Santo公司以及拉夫拉斯联邦大学（UFLA）的食品科学项目提供的技术支持。同时感谢拉夫拉斯联邦大学的多元用户发酵微生物学实验室（LaMFe，网址：https://icn.ufla.br/lamfe）和农业微生物菌种保藏库（CCMA，网址：https://www.ccma.dbi.ufla.br/）在实验中的技术支持。