《Food Research International》：Quercetin ameliorates intestinal barrier dysfunction by suppressing the PKCα/MLCK signaling pathway in piglets
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肠道屏障功能障碍与炎症相关，槲皮素通过抑制PKCα/MLCK信号通路上调紧密连接蛋白表达，改善断奶猪和IPEC-J2细胞模型的肠道屏障功能。
陈秋宇|梅华迪|方梦瑶|崔怡燕|荣婷|邓盾|田志梅|宋敏|李振明|刘志昌|马贤勇|姚淼
广东省农业科学院动物科学研究所，国家生猪和家禽育种产业重点实验室，农业农村部华南动物营养与饲料科学重点实验室，广东省动物育种与营养重点实验室，广东省动物肉品质量与安全控制与评价工程技术研究中心，中国广州市510640
摘要
肠道屏障功能障碍可导致人类婴儿和幼年动物出现胃肠道疾病和发育迟缓。槲皮素是一种天然黄酮类化合物，具有多种生理活性，如抗炎和抗氧化作用，并显示出改善肠道健康的潜力。然而，槲皮素与肠道屏障完整性之间的确切机制尚不清楚。因此，本研究旨在评估槲皮素是否以及如何能够改善LPS诱导的断奶仔猪和TNF-α诱导的IPEC-J2细胞模型中的肠道屏障功能障碍。结果表明，槲皮素补充显著降低了LPS诱导的仔猪血清、空肠和回肠黏膜中的TNF-α和IFN-γ浓度（P<0.05）。槲皮素还减少了空肠和回肠的隐窝深度（P<0.05），同时显著增加了空肠的绒毛高度与隐窝深度比值（P<0.05）。此外，槲皮素通过降低血清内毒素水平和二胺氧化酶活性（P<0.05），以及上调紧密连接蛋白（ZO-1、occludin和claudin-1）在空肠中的表达和免疫荧光强度（P<0.05），以及回肠中的occludin和claudin-1蛋白表达（P<0.05），从而改善了肠道屏障功能。体外研究进一步表明，槲皮素预处理通过抑制IPEC-J2细胞中PKCα/MLCK信号通路的关键蛋白表达，有效改善了TNF-α诱导的肠道屏障功能障碍（P<0.05）。这些发现表明，槲皮素通过上调紧密连接蛋白的表达来改善肠道屏障功能障碍，可能是通过抑制PKCα/MLCK信号通路实现的。
引言
肠道上皮屏障主要由一层肠上皮细胞和相邻肠上皮细胞之间的紧密连接（TJ）维持（Xu等人，2020年）。它作为一个选择性通透的膜，有助于营养吸收，同时防止腔内病原体和内毒素进入全身循环。大量证据表明，肠道屏障稳态的破坏与各种胃肠道疾病有关（Thaiss等人，2018年；Liang等人，2024a年）。因此，保持肠道上皮屏障的完整性对于疾病预防至关重要。断奶对人类婴儿和幼年动物来说是一个重大的应激事件，可能导致肠道屏障功能障碍，进而引发胃肠道紊乱、炎症和腹泻（Meng等人，2019年）。因此，迫切需要开发安全有效的治疗策略，在断奶期间维持肠道屏障的完整性和功能性，以预防或缓解婴儿和幼年动物的断奶相关肠道疾病。
槲皮素是最广泛分布的黄酮类化合物之一，存在于多种水果、蔬菜和一些草药中（Giuliani，2019年）。与其他黄酮类化合物一样，槲皮素也表现出多种生物和药理活性，如抗氧化、抗炎、抗菌和抗增殖作用，通过调节多种酶和细胞内信号分子实现（Hu等人，2017年；Zhang等人，2020年）。在人类肠道Caco-2细胞上进行的研究表明，槲皮素通过上调肠道TJ蛋白的表达和定位以及降低细胞间通透性来增强肠道屏障的功能完整性（Amasheh等人，2008年；Suzuki & Hara，2009年）。此外，Sun等人发现，日粮中添加200毫克/千克的槲皮素可以改善脂多糖（LPS）诱导的肉鸡的肠道炎症反应和屏障功能（Sun等人，2022年）。另外，先前的研究表明，槲皮素可以改善受运输压力影响的育肥猪的肠道通透性和形态，同时下调促炎细胞因子的mRNA表达，上调ZO-1和occludin的mRNA表达，从而修复肠道屏障损伤（Zou等人，2016年）。然而，槲皮素发挥这些作用的具体机制仍有待探索。
肌球蛋白轻链激酶（MLCK）在调节TJ的结构完整性中起着关键作用。MLCK的激活会通过触发F-actin的转移和随后通过磷酸化肌球蛋白轻链（MLC）重新分布TJ蛋白，从而导致肠道上皮屏障功能障碍（Wang等人，2018年）。蛋白激酶Cα（PKCα）是PKC家族中的一个亚型，已被确定为多种细胞过程的介质，并与屏障功能密切相关（Hsu等人，2018年；Song等人，2001年）。PKC信号通路的激活已被证明可以通过促进MLC的磷酸化来上调MLCK的表达，从而增加TJ的通透性（Lin等人，2015年；Turner等人，1999年）。同时，槲皮素已被证明可以直接抑制人类Caco-2细胞（Suzuki & Hara，2009年）和人类真皮成纤维细胞（Sim等人，2007年）中的PKC亚型。此外，槲皮素可以减弱去甲肾上腺素诱导的血管平滑肌细胞中MLCK蛋白表达和p-MLC水平的增加（Kim等人，2017年）。如上所述，槲皮素已被证明可以通过调节TJ蛋白的表达来减少肠道炎症并增强肠道屏障功能。然而，槲皮素对仔猪的影响仍很大程度上未得到探索，其通过调节TJ蛋白来增强肠道屏障功能的能力及其潜在机制尚未完全阐明。
在这项研究中，由于仔猪在肠道解剖结构、生理功能和基因组方面与人类婴儿相似（Tian等人，2019年），因此将其作为人类婴儿胃肠道研究的模型。脂多糖（LPS）是一种典型的细菌内毒素，广泛用于临床前模型中，以诱导断奶仔猪的受控系统炎症和肠道屏障功能障碍（Hui等人，2020年）。LPS激活TLR4信号通路，触发TNF-α和其他促炎细胞因子的分泌，从而损害肠道上皮的完整性（Omonijo等人，2019年）。TNF-α是已知的肠道屏障功能障碍介质，通过下调紧密连接蛋白、诱导肌动蛋白收缩和随之而来的上皮通透性升高来发挥作用（Lee，2015年）。因此，本研究旨在使用断奶仔猪模型确定槲皮素对LPS诱导的肠道屏障损伤的防护作用，并在TNF-α诱导的IPEC-J2细胞模型中体外解析可能的潜在机制。这些发现表明，槲皮素通过缓解PKCα/MLCK信号通路介导的上皮TJ损失来改善肠道屏障完整性。
材料与方法
关于断奶仔猪的护理和处理的实验方案和程序已获得广东省农业科学院动物护理和使用委员会的批准（许可编号：GAASIAS-2021-017），并遵循中国动物福利和实验方案指南进行。
槲皮素减轻了断奶仔猪血清、空肠和回肠黏膜中LPS诱导的炎症损伤
检测了血清（图1B）、空肠（图1C）和回肠黏膜（图1D）中的细胞因子浓度，包括TNF-α、IFN-γ、IL-1β和IL-2，以反映槲皮素对炎症状态的影响。结果表明，槲皮素与LPS在血清、空肠和回肠黏膜中的TNF-α浓度之间存在显著交互作用（P<0.001）。日粮中添加0.02%和0.04%的槲皮素显著降低了（P<0.05）TNF-α的浓度
讨论
众所周知，肠道上皮屏障功能的完整性对肠道稳态至关重要。许多研究已经证实，断奶应激会导致人类婴儿和幼年动物的肠道屏障功能障碍，进而引发肠道疾病（Chen等人，2018年；Yu等人，2020a年；Zhu等人，2025年）。槲皮素是一种具有多种生理活性的天然黄酮类化合物。本研究证明，槲皮素可以直接抑制
结论
总之，本研究表明，槲皮素可以通过上调紧密连接蛋白的表达和抑制PKCα/MLCK信号通路来缓解仔猪的肠道屏障功能障碍。这些发现为槲皮素如何调节肠道屏障功能提供了新的见解，并支持其作为膳食干预措施来缓解断奶应激相关肠道屏障损伤的潜力。
作者贡献声明
陈秋宇：撰写——初稿，可视化，正式分析，数据管理。梅华迪：撰写——初稿，方法学，正式分析，数据管理。方梦瑶：正式分析，数据管理。崔怡燕：资源准备。荣婷：资源准备。邓盾：资源准备。田志梅：资源准备。宋敏：资源准备。李振明：资源准备。刘志昌：资源准备。马贤勇：撰写——审阅与编辑，资源准备，资金获取。姚淼：撰写——审阅与编辑，
利益冲突声明
作者声明他们没有已知的可能会影响本文工作的财务利益或个人关系。
致谢
本研究得到了国家自然科学基金（32372928, 31902200）、广东省基础与应用基础研究基金（2021A1515012120, 2024A1515030187）、农业科学院高水平科技创新战略建设专项基金-杰出学者（R2023PY-JX015）、国家生猪和家禽育种产业重点实验室（GDNKY-ZQQZ-K2, 2023QZ-NK09, ZQQZ-03, ZQQZ-G06）的支持。
