编辑推荐：
木质素形态影响纤维素酶解效率，通过乙醚和石油醚分馏得到F1（小颗粒紧密）和F2（大颗粒松散）木质素，F2因刚性分子链和松散结构导致12%-15%的非productive吸附，降低水解产率。
Nianjie Feng|Xiaotian Zhu|Xin Wang|Qian Wu|Zhiguo Wang
湖北工业大学材料科学与化学工程学院，中国湖北省武汉市南里路28号，430068
摘要
生物质中木质素的存在显著降低了通过酶水解生产糖类的效率。目前的研究主要集中在基于木质素化学结构的相互作用上，而其颗粒形态的影响则被很大程度上忽视了。在本研究中，通过依次使用乙酸乙酯和石油醚进行分级，获得了两种木质素组分（F1和F2），并随后评估了它们对微晶纤维素酶水解的抑制作用。结果表明，木质素F2具有刚性的分子链，并表现为较大的颗粒（ALF2为33.36纳米，MWLF2为46.58纳米）。由于分子刚性较高，木质素F2颗粒在静电相互作用下表现出更松散的堆积结构，这与颗粒表面暴露的酚羟基含量较高有关。这种特殊的结构增强了纤维素酶的非生产性吸附，导致72小时后水解产率降低了12%–15%。总之，本文首次提出木质素颗粒的形态是影响纤维素酶水解的关键因素。尽管目前的形态学模型还不够全面，但它为研究木质素与纤维素酶之间的相互作用提供了新的见解。
引言
能源危机已成为一个持续的挑战，不仅对生态环境构成威胁，也对国家安全构成威胁[1]、[2]、[3]。从生物质中分离纤维素并将其转化为生物乙醇的能源供应系统在全球范围内受到了广泛关注[4]、[5]、[6]。木质纤维素生物质的酶法糖化是可持续生产生物乙醇的关键步骤，为将纤维素转化为可发酵糖类提供了一条能源效率高的途径[7]。然而，影响酶法糖化的最主要问题是木质素的存在。木质素不仅降低了纤维素酶对底物的可及性[8]，还通过非生产性结合抑制了酶的活性[9]。由此导致的低消化率降低了生物乙醇的生产效率，限制了其产业发展。
为了解决这一问题，研究人员研究了木质素单元以及羧基和羟基含量对纤维素酶非生产性吸附的影响[10]、[11]、[12]。还发现了疏水相互作用[13]、静电相互作用[14]和氢键作用[15]。具体来说，木质纤维素生物质的酶法糖化受到多种相关因素的影响，包括纤维素的可及性、木质素的表面积、木质素的疏水性以及木质素在生物质表面的分布[16]、[17]、[18]。随后，人们投入了大量努力开发去除木质素的预处理策略，如酸增强热处理、深共晶溶剂预处理和金属盐辅助酸预处理[19]、[20]、[21]。同时，木质素的化学改性也被广泛研究作为一种替代策略。通过设计木质素的官能团、表面电荷和分子结构，可以减少纤维素酶的非生产性吸附[22]、[23]。这些发现确实在一定程度上促进了生物乙醇的发展。
然而，木质素与纤维素酶之间的相互作用不仅取决于具体的结构单元和官能团。这类似于经典的“锁钥”结构理论，即木质素以颗粒形式存在，并作为“钥匙”与纤维素酶结合。木质素的化学异质性已有充分记录，但其物理形态——由颗粒大小、堆积密度和表面拓扑结构决定——仍待进一步探索。形态不仅决定了木质素颗粒的性质，还影响了酶的可及性以及后续的消化效率[8]、[10]。同时，水解产物中的木质素通常以颗粒形式存在，这有点类似于溶剂交换和反溶剂方法[24]。这些木质素颗粒直接影响水解产物中糖类的转化效率[25]。因此，评估木质素颗粒的形态将适用于这一实际情况。
众所周知，天然木质素和技术木质素都表现出复杂性和异质性[26]、[27]、[28]。磨木木质素（MWL）是从木质纤维素生物质中提取的木质素片段。碱法制浆过程中产生的黑液中的碱性木质素（AL）可能是技术木质素的最大来源。为了进一步获得具有特定形态的木质素组分，通常使用酸沉淀、膜过滤和溶液萃取等方法。酸沉淀是根据羧基和酚羟基的含量来分离木质素的[29]。膜过滤也可以用于木质素的分离，其效果取决于所使用膜的孔径[30]。使用极性不同的有机溶剂序列来分离具有特定特性的木质素[31]。这种可定制的方法允许调整溶剂类型和分级步骤，以满足特定目标[32]、[33]。因此，通常在实验室中使用特定溶剂的选择性萃取来分级木质素，以便更好地管理木质素的分离[34]。
在本研究中，通过依次使用乙酸乙酯和石油醚对两种木质素（MWL和AL）进行分级，以产生具有不同化学结构和形态特征的颗粒。使用尺寸排阻色谱-多角度光散射（SEC-MALS）、31P核磁共振（NMR）光谱、异核单量子相关（HSQC）NMR光谱和扫描电子显微镜（SEM）对木质素组分进行了全面分析。随后进行了非生产性吸附和酶水解实验，以评估木质素形态对水解效率的影响。此外，还采用了热力学分析、石英晶体微天平-耗散（QCM-D）监测和分子对接技术来模拟木质素与纤维素酶之间的相互作用。本研究旨在从木质素颗粒的形态而非其化学结构出发，探索纤维素酶水解过程中的一些新的抑制机制。
材料
马松（Pinus massoniana）木片由中国江西省林业科学院提供。经过干燥和粉碎后，将木片筛分得到180–250毫米的木粉。使用Bj?rkman方法[35]从木粉中提取了磨木木质素（MWL）。该过程包括苯-酒精萃取、72小时球磨、用二氧烷/水混合物（96:4，v/v）萃取以及无水醚纯化。
堆积密度
木质素依次使用乙酸乙酯和石油醚进行分级（图1a）。溶剂分级可以将木质素分离成不同分子量范围的部分，从高分子量（F1）到低分子量（F2）[44]，如图1b和表1所示。木质素F1不仅分子量较高，而且颗粒密度也较大。从相同流体力学半径（保留时间）下的摩尔质量可以看出，木质素F1的摩尔质量更高。此外，木质素F1还表现出
结论
通过依次使用乙酸乙酯和石油醚进行分级，获得了两种木质素组分（F1和F2）。这两种组分在形态上存在显著差异。木质素F1表现为小颗粒，堆积密度较高；而木质素F2为大颗粒，堆积密度较低。对于木质素F1来说，丰富的分支点（β-O-4?结构）赋予了分子链灵活性，可能形成了“互穿网络”结构
CRediT作者贡献声明
Nianjie Feng：撰写 – 原稿撰写、验证、监督、资源提供、概念构思。Xiaotian Zhu：方法学设计、数据分析、数据整理。Xin Wang：数据可视化、方法学设计、实验研究。Qian Wu：撰写 – 审稿与编辑、资源提供、概念构思。Zhiguo Wang：撰写 – 审稿与编辑、验证、资源提供、项目管理。
利益冲突声明
作者声明他们没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文的研究结果。
致谢
本研究得到了国家自然科学基金（21908048、32472341）和湖北省自然科学基金（2024AFD281）的资助。
