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面对免疫细胞疗法在急性髓系白血病（AML）治疗中面临的持久性挑战，研究人员聚焦于制造工艺中的关键步骤，探讨了在T细胞活化前进行CD4+和CD8+亚群分选是否会影响基于CD123xCD3双特异性衔接器（ENG-T）的T细胞疗法的效能。本研究通过系统比较不同分选策略下ENG-T细胞的特征与功能，发现尽管短期功能无差异，但CD4/CD8预分选的ENG-T细胞在长期体外刺激和体内AML异种移植模型中展现出更优的生存、扩增与肿瘤控制能力。其关键在于分选步骤减少了制造早期炎性细胞因子的暴露，从而避免了T细胞的早期功能印记与耗竭倾向，为优化细胞疗法生产工艺提供了关键依据。
在对抗癌症的战场上，嵌合抗原受体（CAR）T细胞疗法等免疫疗法虽然取得了革命性成功，但在诸如急性髓系白血病（AML）等实体和血液恶性肿瘤中，其疗效仍不理想。一个核心挑战在于，回输到患者体内的工程化T细胞“战斗力”难以持久，容易耗竭，导致疾病复发。科学家们一直在探寻影响这些“抗癌战士”长期作战能力的因素。除了T细胞本身的设计，其“出生”过程——也就是体外制造工艺——也扮演着至关重要的角色。目前，对于在制造之初是否需要对T细胞进行“分门别类”（例如，分选CD4+或CD8+亚群），行业内尚未形成统一标准，这一步骤会增加成本和复杂性，但其必要性一直存在争议。那么，这道看似简单的预处理工序，究竟会不会在T细胞的“基因”里留下深刻烙印，最终影响其在体内的抗癌表现呢？
为了解答这个问题，由Natalie J. Holl等研究人员组成的团队在《Haematologica》期刊上发表了一项深入研究。他们以一款靶向AML相关抗原CD123的分泌型双特异性T细胞衔接器（ENG-T）细胞疗法为模型，系统探究了T细胞预分选对最终产品表型与功能的深远影响。这项研究不仅为优化特定疗法的生产工艺提供了直接证据，更揭示了制造微环境如何通过早期细胞因子信号“编程”T细胞命运的普遍规律。
为了开展研究，团队运用了多项关键技术方法。研究使用了来自健康供者和AML患者的原代细胞。核心方法包括：利用磁珠分选技术（MACS）从未经处理的外周血单个核细胞（PBMC）中分离出CD4+、CD8+或两者混合的T细胞亚群，作为实验起始材料；通过逆转录病毒转导技术，使T细胞稳定表达分泌CD123xCD3双特异性衔接分子的基因；通过流式细胞术、酶联免疫吸附试验（ELISA）和体外细胞毒性实验（如生物发光法）评估细胞的表型、蛋白分泌和短期杀伤功能；建立AML细胞系（MOLM-13）的免疫缺陷小鼠（NSG）异种移植模型，以评估ENG-T细胞的体内疗效和动物生存期；利用长时间活细胞成像系统（Incucyte）进行体外连续再刺激实验，模拟长期抗原暴露，评估T细胞的持久杀伤能力和扩增情况；通过多重细胞因子检测（Luminex）分析制造和刺激过程中培养上清液的炎性因子谱；并对工程化T细胞进行批量RNA测序（RNA-seq），以比较不同分选条件下细胞的转录组差异。
研究结果
无论T细胞是否预分选，CD123xCD3的转导和表达均等同
研究人员通过磁珠分选了CD4+、CD8+或两者（CD4/CD8）的T细胞，并与未经分选的（未分选）细胞进行对比。所有组别的T细胞均能成功转导表达CD123xCD3的病毒载体，且转导效率和CD123xCD3蛋白的分泌水平在各组之间没有显著差异。在培养第7天，未分选和CD4/CD8预分选的ENG-T细胞具有几乎相同的CD4+与CD8+细胞比例。这表明，预分选步骤本身并不影响工程化的基本效率。
各分选组的CD123xCD3双特异性工程化T细胞衔接器细胞的短期体外功能相当
对培养一周后的ENG-T细胞进行免疫表型分析，发现不同分选组之间的T细胞亚群（如初始/干细胞样中央记忆细胞、中央记忆细胞、效应记忆细胞、效应T细胞）分布仅存在微小差异。当与CD123+的AML细胞系共培养时，所有分选条件下的ENG-T细胞都能产生相似水平的活化细胞因子（如IL-2和IFN-γ），并在短期（18小时）细胞毒性实验中展现出同等效力的靶向杀伤能力，且对CD123阴性细胞无杀伤作用。这些结果表明，在短期功能评估中，预分选并未带来明显优势。
CD4和CD4/CD8预分选改善了CD123xCD3双特异性工程化T细胞衔接器细胞在体内的肿瘤控制
然而，当在AML异种移植小鼠模型中进行测试时，差异显现出来。所有接受ENG-T细胞治疗的小鼠都比接受未修饰T细胞的小鼠生存期更长。但重要的是，接受来自CD4预分选或CD4/CD8预分选起始材料制造的ENG-T细胞的小鼠，其生存优势显著优于接受未分选或仅CD8预分选ENG-T细胞的小鼠。其中，接受CD4预分选ENG-T细胞的小鼠甚至达到了“治愈”状态。有趣的是，在治疗时，未分选和CD4/CD8预分选的ENG-T细胞具有相同的CD4+/CD8+比例和相似的亚群组成，暗示其体内表现差异源于更内在的因素。
CD123xCD3双特异性工程化T细胞衔接器细胞的连续再刺激揭示了CD4+和CD8+衔接器T细胞均为必需
为了探究体内差异的机制，研究团队设计了体外连续再刺激实验。他们将ENG-T细胞与AML靶细胞重复共培养，模拟长期抗原暴露。结果发现，要维持持久的抗AML细胞毒性和T细胞存活，CD4+和CD8+ENG-T细胞两者都是必需的。仅含CD4+或仅含CD8+的ENG-T产品在多次刺激后杀伤能力迅速下降。在固定比例的混合产品中，较高的CD4:CD8初始比例（如3:1）与更持久的杀伤能力和更强的T细胞扩增/存活相关。更重要的是，直接比较未分选与CD4/CD8预分选的ENG-T细胞，后者在连续刺激中展现出更优的T细胞扩增和靶细胞清除能力，这复制了体内观察到的差异。
未分选T细胞与预分选T细胞的亚群分布或耗竭标志物表达均无法解释功能差异
进一步分析发现，在长期刺激前后，未分选和CD4/CD8预分选ENG-T细胞在记忆亚群分布以及PD-1、TIM-3、LAG-3等耗竭标志物的表达上均无显著差异。这表明功能差异并非由这些常规的表型指标所驱动。
未分选T细胞在制造早期暴露于炎性环境
关键的线索来自对制造环境的分析。在T细胞活化和扩增的早期（第1-2天），未分选ENG-T细胞的培养上清液中检测到显著更高水平的多种促炎细胞因子和趋化因子，包括CCL2、CCL3、CXCL10、IL-1α、IL-1β、IL-6及其受体等。这些因子多由髓系细胞分泌。到了培养第7天，这些差异基本消失。这表明，在制造的最初阶段，未分选起始材料中存在的非T细胞（如单核/巨噬细胞）释放的炎性信号，可能对T细胞产生了早期“印记”。
未分选T细胞在制造过程中上调了激活和炎症相关标志物
对培养第7天的ENG-T细胞进行批量RNA测序，揭示了更深层的分子差异。尽管整体基因表达相似，但无偏聚类分析能将两组细胞清晰分开。与CD4/CD8预分选的细胞相比，未分选的ENG-T细胞上调了与细胞周期、细胞因子信号、趋化因子信号和效应功能相关的基因。同时，它们下调了与代谢、离子稳态、抗凋亡以及T细胞受体（TCR）信号调控（如WNT、NOTCH通路）相关的基因。这种转录谱表明，未分选的T细胞在制造早期就处于一种更高基础活化、但代谢和稳态调节受损的状态，这可能使其在后续面临持续抗原挑战时更容易耗竭。
患者来源的CD123xCD3双特异性工程化T细胞衔接器细胞的预分选改善了产品特性
最后，研究在AML患者的原代细胞中验证了这一发现。CD4/CD8预分选有效降低了起始材料中CD3阴性细胞（包括白血病原始细胞）的污染。虽然所有组别都能成功产生ENG-T细胞并分泌CD123xCD3蛋白，但未分选组在制造早期同样表现出更高水平的炎性细胞因子（IL-1β, IL-6, CXCL10）。在能够成功扩增的患者样本中，预分选的ENG-T细胞在连续刺激实验中同样显示出更好的扩增潜力。
研究结论与讨论
本研究始于为ENG-T细胞疗法制定临床制造标准，并阐明预分选的生物学效应。核心结论是：尽管短期功能无差异，但CD4或CD4/CD8预分选能产生在体内外长期模型中表现更优的ENG-T细胞。这种优势的机制在于，未分选的T细胞在制造早期被共存的非T细胞（主要是髓系细胞）分泌的炎性细胞因子和趋化因子所“印记”。这种早期炎性环境导致T细胞在转录水平上呈现一种高基础活化但代谢和稳态调节受损的状态，使其在面对长期抗原刺激时，持久性和扩增能力下降，最终影响体内抗肿瘤疗效。
研究强调了CD4+T细胞对于ENG-T疗法持久抗肿瘤活性的必要性，这与CAR-T细胞领域的发现一致。同时，研究也警示了在AML等疾病中，仅使用CD4+分选可能导致白血病细胞污染的风险，因此采用CD4/CD8联合分选是更均衡和安全的策略。对患者样本的研究证实，预分选能减少产品污染，并可能改善在疾病背景下本就受损的T细胞扩增能力。
总之，这项研究证实，在制造前对CD4+/CD8+T细胞进行阳性分选，能产生更优越的ENG-T细胞产品。其深远意义在于揭示了T细胞产品的制造微环境具有高度影响力，制造早期的细胞因子信号可以“编程”T细胞的长期命运。通过分选步骤“净化”起始细胞群，是确保用于治疗恶性疾病的免疫细胞疗法获得长期健康与效能的关键质控手段。这项工作为优化细胞治疗生产工艺、提升产品一致性和疗效提供了重要的科学依据。
