亚历山大藻（Alexandrium catenella）生命周期不同阶段的LSU rDNA拷贝数的地理和季节性比较

《Harmful Algae》：Geographic and seasonal comparison of LSU rDNA copy numbers in Alexandrium catenella life cycle stages

本研究通过定量PCR（qPCR）靶向LSU rDNA基因，优化了Alexandrium catenella休眠胞的定量方法。比较了美国大西洋沿岸及阿拉斯加海域不同季节的休眠胞rDNA拷贝数，发现采样时间显著影响拷贝数，但区域差异不显著。通过硅密度梯度离心浓缩休眠胞，并验证qPCR与显微镜计数的准确性，证实qPCR可作为高效、经济的替代方法用于大规模监测。

　　

M.W. Vandersea | S.R. Kibler | T.E. Harman | L.E. Wilking | J.A. Matweyou | C.E. Hart | J.E. Masura | K.A. St Laurent | C.L. Greengrove

摘要

Alexandrium catenella 是许多能形成囊状的Alexandrium有害藻类之一，这类藻类会引发贝类麻痹中毒。由于A. catenella的囊与其他囊状结构在形态上非常相似，因此通过显微镜从环境样本中识别和定量这些囊状结构既耗时又具有挑战性。在这项研究中，我们采用了分子生物学方法，通过针对LSU核糖体基因的qPCR检测来提高从环境样本中定量囊状结构的效率。为了优化囊状结构的定量分析，我们对A. catenella的rDNA拷贝数进行了区域、季节性和生命周期阶段的调查。据我们所知，这是首次进行此类比较的研究。实验中使用的A. catenella菌株来自缅因湾（GOM）、阿拉斯加科迪亚克岛以及华盛顿州普吉特海湾。研究结果表明，不同区域的囊状结构和营养细胞之间的rDNA拷贝数没有显著差异，但采样时间对囊状结构的rDNA拷贝数有显著影响。通过将qPCR检测的结果与NOAA在缅因湾进行的A. catenella囊状结构调查中获得的显微镜计数结果进行比较，证实了使用qPCR检测估算囊状结构丰度的有效性。建议在监测囊状结构丰度时采用qPCR方法，因为这种方法高效、成本低且节省时间，尤其是在大规模调查中。本研究的结果不仅对A. catenella具有参考价值，也对其他具有相似生命周期策略的有害藻类具有普遍意义。

引言

许多海洋甲藻在其生命周期中会形成底栖囊状结构（Bravo和Figueroa，2014年）。这些底栖囊状结构使甲藻能够在恶劣或变化的环境条件下存活，从而增加了其生存机会，并成为浮游细胞繁殖、遗传多样性维持和物种扩散的重要来源。因此，许多有害藻类（HAB）的底栖囊状结构已成为研究重点已有半个多世纪（Erdtman，1954年）。由于囊状结构在形态上的相似性以及它们通常与沉积物和有机碎屑紧密相关，从环境样本中准确识别和定量甲藻囊状结构具有挑战性（Genovesi等人，2007年）。许多甲藻囊状结构研究面临的一个障碍是难以获得用于研究的浓缩囊状物质（Kamikawa等人，2007年；Erdner等人，2010年；Hattenrath-Lehmann等人，2016年）。许多甲藻会在特定环境信号的作用下形成底栖囊状结构，而这些条件在实验室环境中难以重现，这使得研究人员不得不依赖环境样本作为研究材料（Anderson等人，1984年；Matrai等人，2005年）。这种方法的一些挑战包括囊状结构的错误鉴定以及囊状结构活力的不一致性，可能导致结果偏差。因此，许多研究致力于优化囊状结构的识别和定量方法，以改进监测工作并提高对藻类爆发时间、强度和位置的预测能力（Yamaguchi等人，1995年；Erdner等人，2010年；Park和Park，2010年；Hattenrath-Lehmann等人，2016年；Kim等人，2016年；Perini等人，2019年）。

本研究旨在通过分析LSU rDNA拷贝数的区域性和时间性变化来改进基于qPCR的Alexandrium catenella囊状结构定量方法，并在缅因湾沉积物中通过标准显微镜计数方法对该方法进行验证。A. catenella是许多能形成囊状的Alexandrium有害藻类之一，其产生的毒素可导致贝类麻痹中毒（PSP）（Anderson，1984年；Anderson，1998年）。全球范围内，PSP对人类和海洋生物构成严重健康威胁，并因贝类养殖场的关闭造成重大经济损失。例如，1978年至2011年间，由于缅因湾存在PSP毒素，贝类养殖场的关闭时间长达14至272天（Kleindinst等人，2014年）。A. catenella囊状结构的丰度和分布是NOAA每年对缅因湾Alexandrium有害藻类预测的重要组成部分。目前缅因湾的预测方法依赖于普里穆林染色和手动计数（Yamaguchi等人，1995年），这些方法耗时且需要专门的培训，还存在误鉴定的风险。分子生物学技术的进步提出了使用定量聚合酶链反应（qPCR）方法来提高预测的效率和准确性。qPCR方法可以替代或补充手动计数。本研究采用了Vandersea等人（2017年）描述的qPCR方法，该方法针对A. catenella大亚基核糖体DNA（LSU rDNA）的D1-D3区域。qPCR被广泛认为是进行物种特异性定量估计的强大工具（Arya等人，2005年）。此外，由于基因数据库中包含大量的rDNA序列数据，以及物种特异性rDNA基因位点的可用性，且这些基因在真核生物基因组中高度重复，因此核糖体基因常被用于分子检测方法的开发（Hosoi-Tanabe和Sako，2005年；Dyhrman等人，2006年；Kamikawa等人，2007年；Galluzzi等人，2010年；Garneau等人，2011年；Nagai，2011年；Toebe等人，2013年；Cornett等人，2024年）。

使用rDNA qPCR检测进行细胞丰度估计通常需要标准曲线作为基础。标准曲线包含含有qPCR检测靶点的DNA模板。该模板被定量后进行系列稀释并经过qPCR扩增，然后根据qPCR扩增模板的Cq值确定每个细胞中的rDNA拷贝数，从而计算出细胞丰度。与手动计数相比，qPCR的优势在于速度快且劳动强度低。尽管qPCR方法已在有害藻类研究中应用了二十多年，但文献综述显示关于Alexandrium rDNA拷贝数的研究结果存在较大差异。已发表的关于多种Alexandrium物种的报告显示，每个细胞中的rDNA拷贝数估计范围从约500到约250,000个不等（Galluzzi等人，2004年；Godhe等人，2008年；Erdner等人，2010年；Galluzzi等人，2010年；Garneau等人，2011年；Vandersea等人，2017年；Lee等人，2020年）。

我们的工作基于Erdner等人（2010年）的研究，他们也使用qPCR方法从缅因湾沉积物中估算了囊状结构的丰度。本研究的不同之处在于我们对来自美国多个地区的A. catenella囊状结构中的rDNA拷贝数进行了更全面的调查，并对其进行了时间性分析。此外，我们还评估了一种利用硅密度梯度从沉积物中浓缩囊状结构的方法，以获得可用于构建和比较qPCR标准曲线的纯净囊状样本。这些结果被用于最终确定并应用于整个研究的优化qPCR检测方案。通过将Alexandrium囊状结构的丰度估计结果与NOAA在2020年10月进行的缅因湾Alexandrium囊状结构调查中的标准显微镜计数结果进行比较，验证了该检测方法的有效性。

部分内容

细胞的培养与分离

Alexandrium catenella菌株CCMP 1719、CCMP 1908和ARC 67来自国家海洋藻类和微生物中心（NCMA）以及北卡罗来纳大学威尔明顿分校的藻类资源收藏库。选择这些A. catenella菌株是因为它们来源于缅因湾附近的沿海水域和华盛顿州。此外，还从沉积物中分离出的单细胞培养物中建立了更多的A. catenella菌株（表1）。

密度梯度离心法及DNA提取优化

使用NALCO 1060（一种胶体二氧化硅溶液）通过密度梯度离心法从有机碎屑和沉积物中浓缩A. catenella囊状结构。为了评估硅密度梯度法对囊状结构回收的效率，将来自普吉特海湾的五个沉积物样本分成三组，分别进行NALCO 1060处理和未处理处理。对每组的显微镜计数结果进行比较后发现，NALCO 1060处理组中囊状结构的平均损失率为65%

讨论

本研究全面分析了Alexandrium catenella中的LSU rDNA拷贝数，以用于qPCR检测中的囊状结构丰度估计。据我们所知，这是首次在A. catenella的不同生命周期阶段之间进行区域性和季节性rDNA拷贝数比较的研究。通过从已知浓度的囊状结构和营养细胞中提取基因组DNA并进行qPCR扩增来实现相对rDNA拷贝数的比较。

结论

本研究旨在通过分析LSU rDNA拷贝数的区域性和时间性变化来改进基于qPCR的Alexandrium catenella囊状结构定量方法，并在缅因湾沉积物中通过标准显微镜计数方法对该方法进行验证。我们对A. catenella的LSU rDNA拷贝数进行了全面分析。据我们所知，这是首次在A. catenella的不同生命周期阶段之间进行区域性和季节性rDNA拷贝数比较的研究。尽管A. catenella细胞和...

CRediT作者贡献声明

M.W. Vandersea：撰写——审稿与编辑、初稿撰写、数据可视化、方法验证、实验设计、数据分析、概念构建。S.R. Kibler：撰写——审稿与编辑、方法验证、实验设计、资金获取、数据分析、数据管理、概念构建。T.E. Harman：数据可视化、方法验证、实验设计。L.E. Wilking：数据可视化、方法验证、实验设计。J.A. Matweyou：资源协调、方法设计。