介电屏障放电-冷等离子体在双重天然乳源蛋白与岩藻多糖之间的糖基化调控作用及其在虾青素输送方面的潜力

《Innovative Food Science & Emerging Technologies》：Glycation regulation between dual-natural milk-derived proteins and fucoidan by dielectric barrier discharge-cold plasma and its potential for delivery of astaxanthin

β-LG/β-CN复合物经DBD-CP辅助岩藻糖基化构建新型虾青素递送系统，包封效率达80.57%，胃保护率63.25%，显著提升抗氧化活性及热稳定性。

　　

杨成格|杨英聪|徐珍|宋公帅|张梦娜|龚金燕

中国浙江省科学技术大学生物与化学工程学院农产品生物化学加工技术重点实验室，杭州310023

摘要

牛奶蛋白因其生物相容性和多功能性而成为食品级递送系统的理想构建块。然而，其结构不稳定以及对亲脂性生物活性物质的保护能力有限，这限制了其更广泛的应用。在本研究中，β-乳球蛋白纤维（β-LGF）和β-酪蛋白（β-CN）通过自组装形成双天然牛奶蛋白复合物，随后利用介电屏障放电冷等离子体（DBD-CP）辅助糖基化与岩藻多糖（FD）结合，开发出一种用于虾青素（AST）递送的新型蛋白质-多糖 conjugate。系统地研究了该 conjugate 的结构特性、物理化学性质、抗氧化活性和乳化性能。质量比为1:1的β-LGF/β-CN复合物表现出最佳性能，包括粒径减小、热稳定性提高、表观粘度增加以及最高的DPPH自由基清除活性（21.05%）。CP辅助糖基化使糖基化程度从9.83%增加到18.07%，同时增加了β-折叠片含量，增强了分子间相互作用，并形成了高分子量的 conjugate。LGF-CN-FD conjugate 具有更强的抗氧化能力和结构稳定性。由该 conjugate 稳定的AST乳液实现了最高的包封效率（80.57%）和载药量（10.73%）。体外消化实验显示其具有增强的胃部保护作用（AST保留率63.25%）和改善的生物利用度（51.07%）。本研究表明，CP辅助糖基化能有效调整双牛奶蛋白组装体的结构和功能，为功能性食品中亲脂性生物活性物质的递送提供了一种简单高效的方法。

引言

牛奶富含生物活性成分（如碳水化合物、脂质和蛋白质）。蛋白质成分主要由乳清蛋白（20%）和酪蛋白（80%）组成（Li等人，2026；Wang, Xiang等人，2025）。β-乳球蛋白（β-LG）是乳清蛋白的主要成分，以其形成的半柔性纤维而著称，这些纤维逐渐被视为有价值的基于蛋白质的纳米材料（Yuan, Tian, Wang等人，2025；Yuan, Ye, Guo等人，2025）。许多蛋白质在低pH条件下加热时具有自组装成纤维的天然能力。在纤维形成过程中，会发生蛋白质水解和构象变化（Rostamabadi等人，2025）。这些由食品来源蛋白质形成的线性结构且高长径比的蛋白质纤维表现出稳定的物理化学性质（如乳化、凝胶化和增稠作用）、多功能性（如化学韧性、细胞相容性和抗氧化性），以及在作为抗菌剂、营养素等载体方面的巨大潜力（Chen等人，2022）。Pang等人（2025）证明，酸热诱导的β-LG纤维（β-LGF）具有优异的功能性和低过敏性（Pang等人，2025）。

酪蛋白是α_s1、α_s2、β-和κ-酪蛋白的混合物，含有大量脯氨酸残基和未折叠结构（Wang, Xiang等人，2025；Yan等人，2024）。分子量为24 kDa的β-酪蛋白（β-CN）占总酪蛋白的30%，是一种两亲性蛋白质，因其C端具有低正电荷的疏水结构而N端具有高负电荷（Mao等人，2025；Zhang, Zhai等人，2025）。Wang, Bu等人（2024）发现，β-CN中的丰富脯氨酸残基由于其独特的环状侧链结构促进了β-折叠片的形成（Wang, Jia等人，2024）。由于β-CN独特的结构和界面特性，它受到了广泛关注。作为一种线性蛋白质，β-CN的柔性结构可以通过降低界面张力来赋予其优越的乳化性能，从而可以作为输送必需营养素的载体（Chen等人，2024）。然而，物理化学环境条件的变化（如热处理和pH值）容易导致β-CN聚集，这限制了其在功能性食品领域的应用潜力。Ma和Chatterton（2021）表明，酪蛋白稳定的乳液稳定性可能会因结构缺陷而降低（Ma & Chatterton，2021）。因此，我们假设β-LGF可以与β-CN相互作用，创造出具有多种技术功能的新自组装载体。潜在机制可能是β-LGF纤维桥接作用使刚性纳米颗粒（β-CN）形成多网络结构，这需要进一步探索。

糖基化被认为是一种环保且简单的蛋白质化学修饰方法，其中蛋白质的氨基可以与多糖的羰基共价结合，无需添加化学试剂（Zhang, Wang, Niu等人，2024；Tang等人，2025）。这种修饰可以改变蛋白质的结构和功能性质，主要包括提高热稳定性、改善乳化性能和增强抗氧化性（Chen, Feng等人，2025；Wang, He等人，2025）。Wang, Ding等人（2024）证明，花生蛋白分离物的糖基化修饰可以改变其空间结构，提高其柔韧性并增强乳化性能（Wang, Bu等人，2024）。Mengíbar等人（2017）发现，糖基化反应可以增强蛋白质清除活性氧、断裂自由基链和分解过氧化氢的能力（Mengíbar等人，2017）。传统的糖基化反应主要包含干热和湿热过程，需要较高的能量消耗和较长的反应时间。探索新的方法以简化糖基化过程、降低反应温度、缩短反应时间并提高糖基化效率至关重要。

冷等离子体（CP）技术被认为是一种创新的非热处理方法，可以在非平衡热力学条件下操作，因其能够生成高密度的活性氧和氮物种而受到广泛关注（Deng等人，2025；Song, Xu等人，2026）。介电屏障放电（DBD）-CP是最广泛应用的类型之一，它是在至少有一个电极覆盖有介电层的电极对之间产生的。在DBD-CP处理过程中，高能电子形成活性物种，然后与水或水蒸气反应生成活性物种，主要包括单线态氧、激发态氧、原子氧和臭氧等（Song, Zhao等人，2026；Yawut等人，2024）。活性物种、高能电子和紫外线辐射之间的协同作用在通过交联、解聚和氧化等方式修改蛋白质结构方面起着关键作用，从而增强其物理化学性质和功能（Deng等人，2025）。Zhai等人（2025）证明，DBD-CP辅助糖基化后蛋白质的构象发生了显著变化，主要包括巯基和α-螺旋部分的减少、粒径的增加以及芳香氨基酸微环境的改变（Zhai等人，2025）。然而，DBD-CP处理对双天然牛奶来源蛋白质糖基化的调控机制仍需进一步探索。岩藻多糖（FD）主要由重复的岩藻糖单元和硫酸酯基团组成，属于从褐藻和棘皮动物中提取的硫酸化阴离子多糖。研究表明，FD具有优异的功能效益（如抗氧化、抗血栓和抗凝血作用）和粘度特性，其阴离子基团有助于与蛋白质上的阳离子氨基酸残基相互作用（Yang, Song等人，2025）。Zhu, Chen等人（2024）发现，高接枝度的糖基化椰子球蛋白-FD复合物具有更好的乳化稳定性和更高的电负性（Zhu, Qiu等人，2024）。

虾青素（AST）是一种酮类氧化类胡萝卜素衍生物，以其高抗氧化活性而著称。AST已广泛应用于多个领域（如食品健康、药物研究和水产养殖），并具有积极的健康效果（如抗炎作用、血管保护和代谢增强作用（Jin等人，2024；Wang等人，2026）。然而，由于含有大量共轭双键，AST在水中的溶解度低，在氧气、光线和热的作用下稳定性有限，这限制了其在食品系统中的有效应用。这些挑战促使人们迫切需要开发AST递送系统。研究表明，通过构建的递送系统（如乳液、凝胶和微胶囊）可以增强AST的功能性和生物活性（Wang, Xiang等人，2025；Liu, Duan等人，2025）。然而，一些递送系统价格昂贵、制备复杂且不利于大规模生产。因此，探索简单、高效和新型的方法来保护AST的生物活性并增强其功能特性至关重要。因此，本研究的目的是阐明β-LGF和β-CN之间的相互作用机制，然后探讨DBD-CP处理诱导的双天然牛奶来源蛋白质（β-LGF/β-CN）与FD之间的糖基化形成的 conjugate 复合物。同时探讨了CP辅助糖基化过程的潜在调控机制，并研究了糖基化复合物的结构特性与功能性质之间的关系。最后评估了载有AST的乳液的稳定性和消化特性。本研究可以为设计基于DBD-CP辅助糖基化过程的胶体递送系统提供新的见解。

材料与试剂

β-LG（纯度≥95%，来自牛奶）、AST、Thiaflavin T（ThT）和FD（纯度≥95%）由Aladdin Biological Technology Co., Ltd.（中国上海）提供。β-CN（纯度≥80%）由Sigma-Aldrich（中国上海）提供。山茶油（CAO）从当地超市购买（中国杭州）。所有实验使用的超纯去离子水通过Millipore Milli-Q系统过滤（Millipore，美国马萨诸塞州贝德福德）。其他试剂为分析级，由Lingfeng Co.提供。

形态学

为了阐明β-LGF的微观特性，进行了TEM分析。如图1A所示，β-LGF呈现分散的球形颗粒，粒径范围为5至10 nm。经过CP辅助的酸性热处理后，捕获到了短纤维（200–900 nm）和长纤维（1.0–1.2 μm），并在TEM网格上形成了松散的交织网络（图1B）。这一结果与已有报道一致，得到了β-LGF（Song, Xiang等人，2025）。

结论

本研究成功构建了一种基于β-LGF/β-CN自组装结合DBD-CP辅助糖基化的新型AST递送系统。优化的β-LGF/β-CN复合物（1:1）由于氢键、疏水相互作用和静电吸引的协同作用，表现出增强的结构稳定性、抗氧化活性和界面性能。CP处理显著促进了蛋白质-多糖的糖基化，提高了糖基化程度并产生了有利的效果。

作者贡献声明

杨成格：撰写——初稿。杨英聪：正式分析。徐珍：概念构思。宋公帅：项目管理。张梦娜：撰写——审稿与编辑。龚金燕：资金获取。

伦理批准

本文未涉及任何关于人类受试者的研究。所有关于动物使用和护理的指导原则均遵循了机构、国家和国际标准。

未引用参考文献

Wang, Lin, Wang, Zhang and Tao, 2025

利益冲突声明

作者声明没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文所述的工作。

致谢

本工作得到了国家自然科学基金（编号32302223、32372469、32502123、32502182）、浙江省自然科学基金（编号LZ24C200006）、浙江省重点科技项目（编号2024C04020）、杭州市自然科学基金（编号2025SZRJJ2132）以及国家大学生创新创业训练计划（编号202511057044）的支持。