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Subtilisin固定于金纳米颗粒的纳米复合材料对MCF-7乳腺癌细胞具有显著抗增殖和促凋亡作用，其机制涉及激活caspase-8并抑制NF-κB信号通路，且毒性高于单独金纳米颗粒。
Rua J. Kadhim | Majid S. Jabir | Ghassan M. Sulaiman | Uday M. Nayef | Suresh Ghotekar | Hamdoon A. Mohammed
伊拉克巴格达中等技术大学健康与医疗技术学院
摘要
背景
枯草杆菌（
Bacillus subtilis）可以产生枯草杆菌蛋白酶（一种丝氨酸蛋白酶），该酶也因此得名。早期研究揭示了枯草杆菌蛋白酶对癌细胞系具有很高的细胞毒性。本研究旨在开发具有新结构的化合物，以固定枯草杆菌蛋白酶并提高其作用于目标区域的效率。
目的
本研究旨在评估金纳米颗粒（Au NPs）和金/枯草杆菌蛋白酶纳米复合材料（Au/subtilisin nanocomposites）对MCF-7细胞的抗癌效果，并检测其稳定性、结合强度和毒性。
方法
我们设计并制备了一种新的化合物，将枯草杆菌蛋白酶固定在涂有谷氨酸的金纳米颗粒（GNPs）上。通过表面之间的化学反应实现枯草杆菌蛋白酶在金纳米颗粒上的固定。实验验证了这种纳米复合材料对乳腺癌细胞的抑制作用，并确定了可能促进细胞凋亡的机制。同时，利用分子对接和动力学研究分析了其结合行为、稳定性和潜在毒性。
结果
结果表明，金/枯草杆菌蛋白酶纳米复合材料对MCF-7细胞具有显著的抗增殖作用。研究还证实，该纳米复合材料通过激活caspase-8诱导细胞凋亡。研究发现，与单独使用金纳米颗粒相比，这种纳米复合材料对MCF-7细胞的毒性更强。
结论
本研究表明，固定了枯草杆菌蛋白酶的金纳米颗粒在诱导MCF-7细胞凋亡方面比单独使用金纳米颗粒更有效。金/枯草杆菌蛋白酶纳米复合材料是一种可通过刺激细胞凋亡来治疗乳腺癌的治疗化合物。
引言
药物递送是一个研究领域，旨在有效且精确地将药物输送到目标部位，同时减少对正常细胞的不良影响[1]。近年来，通过使用纳米材料等先进技术，药物递送技术得到了改进，使治疗更加有效、安全且易于应用[2][3]。癌症是一种常见疾病，每年导致全球近一千万人死亡。女性中最常见的癌症是乳腺癌，这种致命疾病可扩散到身体其他部位[4]。每年约有150万女性被诊断出患有乳腺癌，这是女性癌症死亡率较高的主要原因。MCF-7细胞系是研究乳腺癌进展不同阶段的重要模型，是全球乳腺癌研究中的关键细胞系之一[5][6]。谷氨酸是一种非必需氨基酸，存在于动植物的蛋白质中[7][8]。枯草杆菌蛋白酶（EC 3.4.21.14）属于第二大丝氨酸蛋白酶家族，由多种细菌（包括
Bacillus菌株）释放到细胞外，是一种具有商业价值的酶，主要用作洗涤剂添加剂[9][10]。由于其在高pH值、高温和表面活性剂等恶劣条件下的稳定性和活性，类似枯草杆菌蛋白酶的高碱性蛋白酶适用于工业应用[11]。在医学上，枯草杆菌蛋白酶可用于快速去除焦痂而无需手术，通常只需一次四小时的应用[12]。此外，它还能有效抑制
金黄色葡萄球菌和
大肠杆菌形成的生物膜[13]。然而，开发低毒性的药物递送纳米系统仍是一个重要挑战[14]。采用环保方法合成的金纳米颗粒（AuNPs）能够更好地控制纳米颗粒的大小、形状和表面特性，同时避免使用有害化学物质。因此，在研究应用中，这类纳米颗粒表现出更好的治疗效果和更强的癌细胞靶向能力[15][16]。我们假设，固定了枯草杆菌蛋白酶的金纳米颗粒（AuNP–Subtilisin）通过诱导细胞凋亡和抑制NF-κB信号通路，将比游离的枯草杆菌蛋白酶或单独的金纳米颗粒具有更强的抗乳腺癌活性。为此，我们设计了一种新的药物递送系统，将枯草杆菌蛋白酶固定在涂有谷氨酸的金纳米颗粒上。实验结果证实，这种纳米颗粒对MCF-7细胞具有显著的治疗效果，表现出通过诱导细胞凋亡（如caspase-8过度表达和NF-κB表达降低）杀死乳腺癌细胞的潜力。
试剂和材料
本研究中使用的细胞系MCF-7和MCF-10均购自Sigma（美国）。培养基为RPMI-1640（Gibco，美国）。实验所用试剂包括链霉素（100 μg/mL）、青霉素（100 U/mL）、胰蛋白酶-EDTA（Biosource，比利时）、5%胎牛血清（Sigma）、生理盐水（DDW，Sigma）、四氯化金（AuCl?）溶液（Sigma）、枯草杆菌蛋白酶（Sigma）、MTT染色剂（Fisher Scientific）、DMSO（Fisher Scientific）、AO/PI染色剂（Thermo）、琼脂糖（LMAgarose；Trevigen，美国）以及DCFDA染料（Sigma）。此外，还使用了Thermo Fisher公司生产的Cellomics? Nuclear Factor-B试剂盒。
金纳米颗粒（AuNPs）及载有枯草杆菌蛋白酶的纳米颗粒的合成与表征
金纳米颗粒通过使用谷氨酸合成，谷氨酸既作为还原剂也作为封端剂。随后在中性条件下用戊二醛对纳米颗粒进行包覆。枯草杆菌蛋白酶通过醛基与枯草杆菌蛋白酶的胺基之间的Schiff碱键被负载到金纳米颗粒上。利用透射电子显微镜（TEM）观察了酶固定前后金纳米颗粒的形态和尺寸（见图1）。
结论
将枯草杆菌蛋白酶固定在涂有谷氨酸的金纳米颗粒上，成功构建了一种有效的药物递送系统。该过程简单且成本效益高。实验结果表明，金/枯草杆菌蛋白酶纳米复合材料作为抗癌剂对MCF-7细胞具有显著效果。此外，这种纳米复合材料可通过诱导caspase-8激活来刺激细胞凋亡，并抑制NF-κB的转位。本研究旨在提高枯草杆菌蛋白酶和金纳米颗粒的细胞毒性。
作者贡献声明
Rua J. Kadhim： 负责撰写、审稿与编辑、初稿撰写、数据可视化、结果验证、方法学设计、实验设计、数据分析及概念构建。
Majid S. Jabir： 负责撰写、审稿与编辑、初稿撰写、数据可视化、结果验证、实验监督、软件应用、方法学设计、数据分析及概念构建。
Ghassan M. Sulaiman： 负责撰写、审稿与编辑、初稿撰写、数据可视化、结果验证、实验监督及数据分析。
利益冲突声明
作者声明没有已知的可能影响本文研究的财务利益或个人关系。
Rua J. Kadhim
伊拉克技术大学应用科学学院生物技术系博士生；
ruaa_jawad@mtu.edu.iq
(R.J.K.)
伊拉克技术大学应用科学学院生物技术系博士生；
https://scholar.google.com/citations?user=-IuTaKAAAAAJ&hl=en&authuser=1
https://scholar.google.com/citations?user=-IuTaKAAAAAJ&hl=en&authuser=1
