《International Dairy Journal》：Molecular and functional characterization of
Enterococcus faecalis OB15: A hypoallergenic and antimicrobial starter from Tunisian Rigouta cheese
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筛选传统发酵食品中的乳酸菌对开发功能性菌株至关重要。本研究对分离自突尼斯Rigouta奶酪的Enterococcus faecalis OB15菌株进行特性分析，发现其具有显著酪蛋白水解活性（最佳pH 6.5、温度37-42℃），通过金属蛋白酶机制（GelE酶）降解β-酪蛋白抗原表位，使IgG免疫反应降低61%。同时，该菌株对大肠杆菌、李斯特菌等食源性致病菌具有抑制作用，且不携带vanA/vanB和hdc基因。基因分析结合分子对接证实，GelE酶通过切割β-酪蛋白短肽片段破坏抗体识别，为开发低致敏性乳制品提供了新资源。
Neyssene Aissaoui|Takoua Ben Hlel|Olfa Baccouri|Leila Ben Farhat|Kamel Eddine El Mecherfi|Ferid Abidi
蛋白质工程与生物活性分子实验室（LIP-MB），突尼斯迦太基大学应用科学技术国家研究所，邮政信箱676，1080，突尼斯Cedex
摘要
从传统食品中筛选乳酸菌对于识别具有技术潜力的菌株至关重要。从突尼斯Rigouta奶酪中分离出的Enterococcus faecalis OB15菌株，对其技术特性、抗菌性能和低过敏性进行了研究。该菌株对牛α-酪蛋白、β-酪蛋白和β-乳球蛋白具有显著的蛋白水解活性，最佳活性条件为pH 6.5和37–42°C。抑制剂实验表明其作用机制为金属蛋白酶活性，这与明胶酶（GelE）的活性一致。计算机模拟对接分析证实GelE靶向免疫优势β-酪蛋白表位，导致产生的片段过短而无法被抗体识别。这种结构降解导致IgG免疫反应性降低了61%。通过琼脂扩散实验测得的抗菌活性显示，该菌株对革兰氏阳性和革兰氏阴性食品病原体均具有抑制作用，包括大肠杆菌（9.5 ± 0.3 mm）、李斯特菌（8.5 ± 0.2 mm）、金黄色葡萄球菌（8.2 ± 0.2 mm）和鼠伤寒沙门氏菌（8.0 ± 0.5 mm）。此外，该菌株缺乏万古霉素抗性（vanA/vanB）和组胺脱羧酶（hdc）基因。这些发现表明E. faecalis OB15作为开发低过敏性发酵乳制品的发酵剂具有巨大潜力。
引言
乳酸菌（LAB）是一类异质性的革兰氏阳性微生物，多年来一直被用作发酵乳制品（如奶酪和酸奶）的发酵剂（Gereková等人，2011年）。由于它们独特的代谢方式，可以改善发酵产品的工艺、营养和感官特性。实际上，乳酸菌通过糖代谢产生大量乳酸，并具有多种生物活性，如蛋白酶、肽酶和脂肪酶（Wang等人，2022年）。
肠球菌常见于传统生牛奶的微生物群中，其中E. faecalis和E. faecium是最常见的肠球菌种类（Go?a?-Pr?dzyńska等人，2022年）。由于它们能够在高盐度和低pH的严格环境中生长，并具有蛋白水解和脂肪分解能力，因此对最终产品的成熟和感官特性的形成起着重要作用（Ahmadova等人，2011年；Farahian等人，2025年）。
蛋白水解被认为是许多发酵乳制品生产过程中最重要的生化反应之一（García-Cano等人，2019年）。在此过程中释放的游离氨基酸对牛奶微生物群的生长起着关键作用。多项研究显示E. faecalis的蛋白水解活性最强（Ahmadova等人，2011年；Worsztynowicz等人，2019年）。此外，用蛋白水解性肠球菌处理酪蛋白和乳清蛋白组分可以减少抗原反应，这提示可以在低过敏性乳制品的生产中利用这些水解产物（Bíscola等人，2016年），从而可能提高人们对牛奶蛋白的耐受性。事实上，牛奶过敏（CMA）占所有食物过敏病例的9%（Bíscola等人，2016年）。CMA的症状因患者而异，包括胃肠道问题和皮肤问题，在极端情况下还可能出现哮喘、鼻炎和过敏性休克（Gaudin等人，2008年）。
在之前的研究中，我们从突尼斯的Rigouta奶酪中分离出一种E. faecalis菌株，并将其命名为E. faecalis OB15（Baccouri等人，2019年）。该菌株通过MALDI-TOF-MS（基质辅助激光解吸-飞行时间质谱）生物分型系统进行了鉴定。与作为益生菌参考的E. faecalis Symbioflor 1克隆DSM 16431相比，OB15菌株满足了有效益生菌的主要要求（黏附性、增强上皮屏障功能、耐受肠道环境）。初步的基因组分析表明E. faecalis OB15可能是安全的，因为一些肠球菌菌株中常见的毒力基因缺失。此外，使用体内模型也证实该菌株无毒性（Baccouri等人，2019年）。尽管已经确定了其益生菌潜力，但负责其技术特性的具体酶机制，尤其是过敏原表位的降解机制，仍有待进一步阐明。将基因组分析与分子建模相结合，为将遗传潜力与表型功能联系起来提供了现代方法。
本研究的目的是评估从突尼斯发酵乳制品Rigouta中分离出的Enterococcus faecalis OB15的蛋白水解、抗菌和低过敏性特性，并通过基因组分析和计算机模拟分子对接技术对其低过敏性活性进行深入研究。
章节片段
细菌菌株和培养条件
E. faecalis OB15在MRS培养基中常规培养，温度为37°C，培养24小时后，置于添加了20%甘油的MRS培养基中冷藏于-80°C。使用前，该菌株需在UHT脱脂牛奶中重新激活两次，然后再在MRS培养基中培养（Baccouri等人，2019年）。
E. faecalis OB15的细胞生长和酸化活性
通过测量接种了108 CFU mL-1（占培养起始量的5%）的MRS培养基的光密度（OD）来评估E. faecalis OB15的生长情况。使用Bioscreen设备在24小时内监测OD值。
生长和酸化曲线的测量
图1a显示了E. faecalis OB15在MRS培养基中的生长情况（OD600nm）和酸化曲线。该菌株的生长速率较高，最大光密度（A600nm）为2.81。在相同条件下培养24小时后，pH值逐渐从6.8降至5.08。图1b还展示了E. faecalis OB15在UHT脱脂牛奶中的生长能力（log CFU mL-1）和酸化活性。观察到的结果相似，但差异较小。
讨论
从传统食品中筛选乳酸菌是识别具有工业发酵潜力菌株的重要策略（Meruvu & Harsa，2023年）。在此背景下，乳酸菌能够高效生长并酸化乳制品底物，这是它们作为发酵剂或辅助培养物的关键前提，因为这直接影响产品的安全性、质地和感官特性（Leroy & De Vuyst，2004年）。
生长和酸化过程
结论
本研究提供了关于从突尼斯传统乳制品中分离出的肠球菌菌株的技术特性和安全性的重要见解。我们的研究发现，从突尼斯Rigouta奶酪中分离出的E. faecalis OB15对酪蛋白具有良好的蛋白水解活性，安全性较高，并对某些食源性病原体具有抗病原体作用。基因组分析与计算机模拟分子对接结果表明GelE蛋白酶可能参与了这一过程。
CRediT作者贡献声明
Ferid Abidi：监督、概念设计。Leila Ben Farhat：研究。Kamel Eddine El Mecherfi：方法学、概念设计。Olfa Baccouri：撰写初稿、研究、数据分析。Neyssene Aissaoui：撰写初稿、研究、数据分析。Takoua Ben Hlel：撰写、审稿与编辑、数据整理
未引用参考文献
O'Sullivan等人，2015年。
写作过程中使用生成式AI和AI辅助技术的声明
在准备本论文时，作者仅使用ChatGPT来辅助写作。作者对内容进行了必要的审核和编辑，并对出版物的内容负全责。
资金支持
本研究未获得任何公共部门、商业机构或非营利组织的资助。
利益冲突声明
作者声明没有已知的可能影响本文工作的财务利益或个人关系。
致谢
本项工作得到了突尼斯迦太基大学应用科学技术国家研究所（INSAT）蛋白质工程与生物活性分子实验室（LIP-MB）的支持。
