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SARS-CoV-2主蛋白酶三种重组表达策略的比较研究：通过SMH、HSM和HSqaM三种系统化设计的表达体系，验证了SUMO标签与His标签融合策略在保持Mpro authentic N-terminus和活性方面的等效性，其中HSqaM变体创新性地利用P1位点Q→A突变实现可控自加工，无需外源蛋白酶或咪唑裂解，显著简化纯化流程并适用于其他敏感N-terminus的蛋白酶表达优化。
Pavel Novotny|Adéla Moravcová|Veronika Nováková|Lucie Bednárová|Zdeněk Voburka|Ji?í Brynda|Radko Sou?ek|Ta?ána Majerová
捷克科学院有机化学与生物化学研究所，布拉格，捷克共和国
摘要
在SARS-CoV-2复制过程中，主要蛋白酶（Mpro）会自催化地从病毒多聚蛋白中切割出来，并形成一个活性二聚体，该二聚体将多聚蛋白加工成功能性蛋白质。为了保持其活性，Mpro必须保留其天然的N端结构。高质量的Mpro对于生化、结构学和抗病毒研究至关重要。我们比较了三种表达活性Mpro的载体设计策略。第一种策略采用了自加工融合技术，其中SUMO结构域之后是Mpro的天然切割位点以及C端的HisTag，从而能够高效地释放出具有天然N端和标记C端的Mpro。第二种策略利用了外部蛋白酶切割，即HisTag–SUMO–Mpro融合体，需要ULP-1蛋白酶来去除N端的融合部分，从而恢复Mpro的天然N端结构及其酶活性。第三种策略使用了一种自加工变体，其中HisTag–SUMO结构域通过一个突变的切割位点与Mpro连接，使得Mpro能够在Ni–NTA树脂上缓慢自加工，而无需外源性蛋白酶或咪唑洗脱，从而减少了纯化步骤。这三种方法得到的Mpro在N端结构、圆二色光谱、动力学参数和热稳定性方面均相似。这些蛋白质适用于生物物理研究和结晶实验。
引言
冠状病毒利用宿主的翻译机制将其酶和辅助蛋白翻译成两种大的多聚蛋白：pp1a和pp1ab [1]。这两种多聚蛋白中都含有SARS-CoV-2的主要蛋白酶（E.C. 3.4.22.69），在文献中也被称为Mpro、nsp5或3-胰凝乳蛋白酶样蛋白酶（3CLpro）[2]。为了完全激活，Mpro必须从其多聚蛋白前体中自催化地切割出来。同时，两个Mpro单体亚单位需要组装成一个功能性同源二聚体，然后该二聚体会在多个位点切割病毒多聚蛋白，生成复制和组装所需的各个蛋白质 [3]，[4]。鉴于Mpro在病毒生命周期中的关键作用，它是一个经过验证且被广泛研究的药物靶点 [5]。目前，几种Mpro抑制剂已经在世界各地进入临床使用阶段，还有几种正处于不同测试阶段 [6]。
高纯度的Mpro的生产对于药物筛选、生化特性分析和结构研究至关重要。激活Mpro需要精确去除其前体中的N端延伸部分。与其他胰凝乳蛋白酶样蛋白酶类似，天然的N端结构对于底物结合口袋的正确折叠和实现完整的酶活性至关重要，而C端的修饰通常是可以接受的 [7]。
一种成熟的Mpro生产方法是将其作为酶原蛋白表达，该酶原蛋白的两侧分别带有其天然的N端切割序列和C端标签 [8]，[9]。在表达过程中，酶会发生自催化的N端加工，从而产生具有天然N端的成熟Mpro。或者，Mpro也可以作为融合蛋白的一部分表达，随后通过外部蛋白酶切割释放 [10]。在我们之前的研究中，我们发现，在天然N端切割位点的P1位置进行替换并不一定会消除Mpro酶原形式的cis自加工。相反，适当选择的突变可以调节自加工速率，使得在表达和纯化过程中持续缓慢释放成熟的Mpro [11]。这里的“缓慢加工”指的是那些未处理的酶原蛋白能够在实际的时间尺度上继续进行自加工的变体。操作上，我们将自加工半衰期（t?）在2到10小时之间的变体定义为缓慢加工变体。
在这里，我们系统地评估了在大肠杆菌（E. coli）中表达和纯化重组Mpro的三种方法，并将我们最初的基于突变的设计策略与两种常用的表达构建方法进行了对比。为了进行这种并行比较，我们生成了三种构建体，这些构建体在融合元素（标签位置）和N端加工位点的序列上下文上有所不同，同时保持Mpro的核心部分不变。原则上，每种策略都可以使用不同的标签配置。我们使用十组氨酸标签（HisTag）进行纯化，以便在Ni–NTA树脂上进行亲和捕获。SUMO标签主要作为溶解性模块添加，因此原则上可以省略。在第一种构建体SUMO–Mpro–HisTag（SMH）中，SUMO结构域通过Mpro的天然N端切割位点与其连接，随后是C端的十组氨酸标签（HisTag）（图1A）。在表达过程中，Mpro在N端发生自切割，产生具有天然N端和可去除的C端HisTag的活性形式。第二种构建体HisTag-SUMO-Mpro（HSM）包含一个N端HisTag和SUMO结构域（图1B）。以这种形式表达的Mpro催化活性受损，需要通过类泛素蛋白酶1（ULP-1）在纯化后去除N端的融合部分，以恢复其活性。第三种构建体HisTag–SUMO–QA–Mpro（HSqaM）在天然切割位点的P1位置进行了谷氨酰胺到丙氨酸的突变（图1C）。这种突变减缓了自加工速度，使得成熟的Mpro可以直接从Ni–NTA树脂上释放出来，同时具有天然的N端和C端结构，无需咪唑洗脱或外部蛋白酶处理。这便于直接更换缓冲液并简化了后续操作。
我们比较了这三种表达方法得到的Mpro的产量、纯度和生化特性，并讨论了每种方法的优点和局限性。这些方法也可能适用于其他因N端延伸而活性受影响的蛋白酶的表达。
尽管已经描述了多种Mpro的表达和纯化方案，但缺乏对不同设计的系统比较。通过直接在相同条件下比较三种不同的构建体，这项工作对产量、加工复杂性和下游适用性之间的权衡提供了重要的见解。此外，缓慢自加工的变体（HSqaM）能够直接从亲和树脂上释放，消除了对外部蛋白酶或咪唑的需求。这种简化的设计也有潜力应用于其他具有N端融合的酶原蛋白。
材料
寡核苷酸从GeneriBiotech购买。限制性内切酶（NcoI、AgeI、XmaI和BamHI）、T4 DNA连接酶、Phusion DNA聚合酶以及细菌菌株NEB 5-alpha Competent E. coli和T7 Express lysY/Iq Competent E. coli来自New England Biolabs。Benzonase?核酸酶（Merck Millipore）用于纯化过程中的DNA切割。Western blot检测使用了SARS-CoV-2 Mpro抗体#51661S（Cell Signaling Technology）。Minipurification
表达载体的构建
为了生成具有天然末端的活性SARS-CoV-2 Mpro，我们设计了一系列基于HisTag、SUMO、Mpro及其N端自加工位点变异体的模块化表达系统。基于pET16b载体构建了三个表达质粒，每个质粒编码一个不同的融合蛋白（图1，补充图S1）。第一个构建体SUMO–Mpro–HisTag（SMH）（图1A，补充图S1A）中，SUMO结构域通过Mpro的天然N端切割位点与其连接，随后是
讨论
本研究系统地比较了三种重组生产SARS-CoV-2主要蛋白酶（Mpro）的策略。尽管这些构建体在激活机制和纯化复杂性上有所不同，但最终得到的蛋白酶在结构和生物物理特性上具有可比性。纯化流程如图8所示。当使用小规模纯化策略时，不同构建体的产量和比活性存在差异（补充图S2A–E）。然而，这些
结论
总之，三种表达策略——SMH、HSM和HSqaM——都产生了具有相似结构和功能特性的Mpro，这一点通过活性测定、CD光谱、质谱分析、N端测序和DSF分析得到了证实。虽然SMH和HSM构建体通过基于标签的纯化和表达后标签去除提供了灵活性，但HSqaM构建体提供了一种简化方案，消除了对咪唑洗脱和外部蛋白酶处理的需求。
CRediT作者贡献声明
Pavel Novotny：撰写 – 审稿与编辑，撰写 – 原稿，可视化，方法学，研究，资金获取，形式分析，数据管理，概念化。Adéla Moravcová：撰写 – 审稿与编辑，方法学，研究。Veronika Nováková：撰写 – 审稿与编辑，方法学，研究。Lucie Bednárová：撰写 – 审稿与编辑，方法学，研究，形式分析。Zdeněk Voburka：撰写 – 审稿与编辑，研究，形式分析，
写作过程中生成式AI和AI辅助技术的声明
在准备这项工作时，作者使用了ChatGPT 4.0（OpenAI）来改进手稿的语法和清晰度。使用该工具后，作者根据需要对内容进行了审阅和编辑，并对出版物的内容负全责。
资助
这项研究得到了国家病毒学和细菌学研究所（EXCELES，LX22NPO5103）——由欧盟下一代EU计划资助——查尔斯大学资助机构（项目50121）以及捷克科学院（AV 21：病毒学和抗病毒治疗计划）的支持。
利益冲突声明
作者声明他们没有已知的可能会影响本文工作的财务利益或个人关系。
致谢
我们感谢Martin Hradilek提供荧光底物Dabcyl-NR(Abu)(Orn)LQSGNSRK-Edans，Edita Kofroňová进行质谱分析，Valerya Stolpyrova和Karolína ?rámková提供技术协助，以及Vlastimil Král在DLS方面的帮助。我们还要感谢Milan Ko?í?ek和Michal Krá?的宝贵意见，以及Jan Konvalinka对手稿的支持和审阅。最后，我们感谢Michael FitzGerald在文本编辑方面的帮助。
