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为提升哺乳动物细胞工厂（尤其是CHO细胞）在生物制造中的生产力，研究团队面临细胞能量供应不足的挑战。传统依赖线粒体氧化磷酸化的产能方式在大型生物反应器的胁迫环境下易受限制。本研究创新性地将细菌来源的精氨酸脱亚胺酶通路导入CHO细胞，旨在构建一条不依赖线粒体的细胞质ATP生成途径。研究结果显示，该工程改造显著提高了细胞内ATP水平，改善了细胞生长、活力及单克隆抗体产量，并降低了糖酵解通量。这为克服工业化生物过程中能量瓶颈提供了全新的、稳健的策略。
在生物制药领域，中国仓鼠卵巢细胞是生产治疗性蛋白质（如单克隆抗体）的主力军。然而，这些“细胞工厂”的产能常常受到能量供应不足的限制。细胞的一切活动，从生长增殖到合成并分泌复杂的蛋白质药物，都离不开一种名为三磷酸腺苷的“能量货币”。传统的ATP生产严重依赖于线粒体，通过糖酵解、三羧酸循环和氧化磷酸化这一系列精密但脆弱的代谢网络来生成。在理想实验室条件下，这套系统运转良好，但一旦进入大规模工业化生产的生物反应器，细胞就会面临氧气受限、营养梯度、活性氧升高等多种环境胁迫，严重制约了线粒体的呼吸产能效率，从而成为提升产品滴度和细胞特异性生产力的关键瓶颈。针对这一问题，以往的研究多聚焦于增强线粒体功能或优化中心碳代谢流，但这并未从根本上摆脱对线粒体呼吸的依赖。那么，能否为细胞安装一条全新的、不受环境胁迫影响的“能量生产线”呢？
近期，一篇发表在《Metabolic Engineering》期刊上的研究给出了肯定的答案。由Mauro Torres等人领导的研究团队独辟蹊径，将目光投向了自然界中一些细菌用于在缺氧或缺糖环境下生存的能量获取途径——精氨酸脱亚胺酶通路。该通路能直接在细胞质中将精氨酸转化为ATP，整个过程完全独立于线粒体。研究团队设想，将这条“细菌发电机”引入哺乳动物细胞，或许能构建一个强大且稳健的补充能量来源，从而提升细胞工厂的整体性能。
为了验证这一设想，研究人员开展了系统性的工程与验证工作。他们首先确认了CHO细胞及其亲本物种中天然缺乏ADI通路组件。随后，他们利用PiggyBac转座子系统，在两种能生产单克隆抗体的工业用CHO细胞系中，稳定表达了来自细菌的三个关键酶基因以及两种精氨酸转运蛋白，构建了名为“ArcABC + ArgT”的工程细胞系。作为对照，他们还构建了仅表达转运蛋白或仅表达绿色荧光蛋白的细胞系。通过一系列精心设计的批次培养、补料分批培养实验，并结合代谢组学、腺苷酸定量、蛋白印迹等技术，研究团队全面评估了工程改造对细胞培养性能、代谢谱和能量状态的影响。
研究结果通过多个维度清晰地展示了ADI通路带来的积极效应。在代谢工程策略与初步筛选部分，研究证实了工程细胞成功表达了外源基因，并且与仅表达转运蛋白或对照的细胞相比，表达完整ADI通路的细胞在早期培养中即显示出更高的单克隆抗体滴度。这初步表明，性能的提升并非仅仅源于精氨酸摄取的增加，而更可能与ADI通路介导的ATP生成有关。
在ADI通路工程化细胞的生物过程表征中，详细的培养数据显示，工程细胞呈现出更高的活细胞密度、更长的100%活力维持期，以及显著提升的单克隆抗体产量和细胞特异性生产力。同时，工程细胞对精氨酸的消耗更快，并特异性积累了鸟氨酸，这为ADI通路在CHO细胞中的功能性表达提供了直接证据。
对ADI通路工程化细胞的代谢评估揭示了一个关键的代谢重塑现象。工程细胞的糖酵解通量整体下降，表现为葡萄糖消耗速率、乳酸和丙氨酸生成速率的降低，而氨基酸和三羧酸循环中间体的代谢谱则大体不变。主成分分析进一步确认了工程细胞与对照组在代谢特征上的显著差异，主要分离因素正是糖酵解相关代谢物。
最核心的发现体现在ADI通路工程化细胞的能量代谢表征中。腺苷酸测量显示，工程细胞在整个培养期间保持了更高的细胞内ATP水平、更低的ADP/ATP和AMP/ATP比值，以及略高的腺苷酸能量荷，表明其处于一个更高的能量状态。与此一致，能量应激传感器AMPK的磷酸化水平在工程细胞中更低，进一步证实了细胞能量匮乏信号的减弱。相关性分析表明，更高的ATP水平、更低的ADP/ATP与AMP/ATP比值，与更高的细胞特异性生产力显著相关。
最后，在通过补充精氨酸或瓜氨酸进行生物过程优化的探索中，研究发现为表达ADI通路的细胞额外补充精氨酸或瓜氨酸（ADI通路的中间产物），可以进一步提升其生长和抗体产量，而对照组细胞则无此响应。在补料分批培养中，工程细胞也展现了更长的活力维持时间和更高的最终抗体产量，证明了该策略在更接近工业生产的条件下依然有效。
综合全文，研究结论与讨论部分指出，尽管通过质量平衡估算，ADI通路直接贡献的ATP仅占细胞总ATP产量的约2-5%，但其触发的次级代谢适应可能是表型改善的关键。高水平的胞质ATP可能通过变构反馈抑制糖酵解关键酶，降低了糖酵解通量，这或许促使碳流转向更高效的氧化代谢或其他生物合成途径。同时，工程细胞对线粒体ATP合酶抑制剂寡霉素A表现出一定的抵抗性，暗示可能存在氧化磷酸化的代偿性上调。此外，精氨酸代谢的改变也可能通过影响mTOR等营养感应通路来调节细胞代谢。这些机制共同作用，重塑了细胞代谢网络，最终实现了在提升能量状态的同时，增强细胞生长和蛋白质合成能力的目标。
这项研究的重要意义在于，它成功地在哺乳动物细胞中重构了一条全新的、不依赖线粒体的ATP合成途径，为突破哺乳动物细胞工厂的能量供应瓶颈提供了原创性解决方案。它不仅是代谢工程领域的一项概念验证，更开辟了一个通过合成生物学模块增强细胞性能的新范式。该策略的稳健性使其在面临工业生物过程中常见的环境胁迫时更具优势，并具有扩展到HEK293细胞等其他哺乳动物生产细胞平台的潜力，对生物制药产业的增效降本具有深远影响。当然，研究也指出了未来的方向，包括精确量化ADI通路的代谢通量、阐明其主导的作用机制、评估对产品质量属性的影响，以及优化培养基配方以充分发挥该系统的潜力。
