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滩羊HDAC2通过响应LH信号调控组蛋白乙酰化及EGF-like因子分泌影响卵母细胞成熟，实验采用COC和颗粒细胞共培养系统，结合免疫组化、荧光、RT-qPCR和Western blotting验证HDAC2在卵泡各阶段核定位，发现FSH显著上调HDAC2表达（P<0.05），而LH在2小时处理中显著下调其mRNA和蛋白水平（P<0.01）。20μM CAY10683抑制剂显著提升H4K12ac乙酰化水平（P<0.001）和EREG的mRNA（P<0.01）及蛋白表达（P<0.001），同时提高卵母细胞体外成熟率。
何俊丽|徐雅秀|王向艳|齐志鹏|吕东环|宋宏远|严玉洁|王静华|闵思瑞|夏国亮|陈强|刘新峰
教育部西部特殊生物资源保护与利用重点实验室，宁夏大学，银川，宁夏750021，中国
摘要
本研究旨在探讨组蛋白去乙酰化酶2（HDAC2）在滩羊卵泡发育和卵母细胞成熟中的潜在机制，明确其是否通过响应黄体生成素（LH）信号、调节组蛋白乙酰化以及促进类表皮生长因子（EGF）因子的分泌来影响卵母细胞成熟。通过卵丘-卵母细胞复合体（COC）和颗粒细胞共培养系统评估了HDAC2抑制剂对卵母细胞成熟率的影响。相关指标采用免疫组化、免疫荧光、逆转录-定量聚合酶链反应（RT-qPCR）、Western blotting和酶联免疫吸附测定（ELISA）进行检测。结果表明，HDAC2定位于滩羊卵泡各阶段颗粒细胞和卵母细胞的细胞核中，在卵泡发育过程中其表达显著上调（P?）。RT-qPCR和Western blotting结果显示，FSH显著上调了颗粒细胞中的HDAC2 mRNA和蛋白质表达（P?或P?），而LH在处理2小时后显著下调了HDAC2的mRNA和蛋白质水平（P?或P?）。20?μM的特异性HDAC2抑制剂CAY10683处理显著增加了颗粒细胞中组蛋白H4第12位赖氨酸的乙酰化水平（H4K12ac）（P?），并特异性促进了颗粒细胞中epiregulin（EREG）的分泌和表达（mRNA和蛋白质水平均P?或P?）。此外，CAY10683还提高了卵母细胞的体外成熟率。综上所述，HDAC2通过响应LH信号影响滩羊卵母细胞的成熟，结果表明H4K12乙酰化与EREG分泌之间存在潜在联系，为研究羊卵母细胞的表观遗传调控提供了依据。
引言
滩羊是中国重要的肉用羊品种，其繁殖性能直接影响养殖的经济效益[1]。卵母细胞成熟是繁殖过程中的关键步骤，决定了受精的成功和早期胚胎发育的质量[2]、[3]、[4]、[5]。卵母细胞成熟不是一个独立的过程，而是依赖于卵泡内颗粒细胞和卵母细胞之间的密切相互作用[6]、[7]，其中颗粒细胞分泌的细胞因子和促性腺激素的调控作用尤为重要[8]、[9]。
组蛋白去乙酰化酶（HDACs）通过调节组蛋白乙酰化水平参与染色质重塑和基因表达调控[10]、[11]、[12]，在细胞增殖、分化和个体发育中起核心作用[13]、[14]、[15]、[16]。先前的研究表明，HDAC家族成员（如HDAC1和HDAC3）调控哺乳动物的卵泡发育、卵母细胞成熟和类固醇激素合成[17]、[18]。然而，HDAC2在羊卵泡发育和卵母细胞成熟中的具体作用及分子机制尚不明确。
黄体生成素（LH）是触发排卵和最终卵母细胞成熟的关键信号[19]，其下游分子途径涉及多种转录调控因子和表观遗传修饰。研究表明，类表皮生长因子（EGF）家族成员（如amphiregulin（AREG）、epiregulin（EREG）和betacellulin（BTC）是LH下游的关键效应因子，直接介导卵母细胞成熟[20]、[21]。近年来，表观遗传修饰（尤其是组蛋白乙酰化）在生殖调控中的作用受到越来越多的关注[22]、[23]。然而，LH如何与HDAC2表达相互作用以影响颗粒细胞功能，进而通过组蛋白乙酰化修饰调节类EGF生长因子的分泌并最终影响卵母细胞成熟的调控网络仍不清楚。
本研究以滩羊为研究对象，探讨HDAC2在卵巢卵泡发育过程中的定位和动态表达模式，以及HDAC2是否响应促性腺激素LH信号，以及HDAC2是否通过特定的组蛋白乙酰化位点调节类EGF因子的分泌，从而影响卵母细胞成熟。研究结果将初步阐明HDAC2在滩羊卵母细胞成熟中的表观遗传分子调控途径，为开发滩羊及其他家畜卵母细胞的新型体外成熟系统提供重要理论基础。
动物实验伦理声明
本研究的动物实验方案已获得宁夏大学科学技术伦理委员会的批准，并按照其指南进行（批准编号：NXUA-2024-0156）。
卵巢采集
卵母细胞来自宁夏回族自治区银川市的当地屠宰场。新鲜卵巢置于预先加热至37°C的生理盐水中（含有双抗体），并在2–4小时内运输至实验室。
主要试剂
特异性HDAC2抑制剂CAY10683（MCE，
HDAC2定位于滩羊卵巢各阶段卵泡的颗粒细胞和卵母细胞的细胞核中
为了明确HDAC2在滩羊卵巢卵泡发育过程中的细胞定位，采用了免疫组化和免疫荧光技术进行检测。免疫组化结果显示，以IgG作为阴性对照，HDAC2在初级卵泡、次级卵泡、窦状卵泡和排卵前卵泡的颗粒细胞和卵母细胞核中均有表达（图1A）。免疫荧光进一步验证了这一结果，显示HDAC2
讨论
本研究首次探讨了HDAC2在滩羊卵泡发育和卵母细胞成熟中的机制，初步揭示了HDAC2响应LH信号的表观遗传调控途径，其与调节H4K12乙酰化和EREG分泌有密切关联，从而介导卵母细胞成熟。这些发现为进一步理解羊卵母细胞成熟的分子机制提供了新的视角。
本研究证明HDAC2可以
结论
本研究证实HDAC2能够响应LH信号。抑制HDAC2可上调H4K12的乙酰化水平以及EREG的分泌和表达，从而促进滩羊卵母细胞的成熟。这项研究不仅丰富了卵泡发育中的表观遗传调控理论，还为开发提高羊卵母细胞体外成熟效率的新系统提供了潜在的目标和理论基础。
作者贡献声明
何俊丽和徐雅秀：概念构思、实验设计、数据分析、初稿撰写。王向艳、齐志鹏、吕东环、宋宏远、严玉洁、王静华和闵思瑞：实验设计、数据分析。夏国亮和陈强：数据解读、审稿和编辑。刘新峰：资金筹集、概念构思、项目监督、数据讨论。
资助
本研究得到了国家自然科学基金（资助编号：32160791）、宁夏回族自治区自然科学基金的重点项目（资助编号：2024AAC02019）以及宁夏回族自治区重点研发计划（人才引进专项）（资助编号：2024BEH04111）的支持。
利益冲突声明
所有作者确认本研究在没有任何可能被视为潜在利益冲突的情况下进行。
致谢
我们感谢宁夏回族自治区银川市的屠宰场提供滩羊的卵巢样本。
