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本项研究证实，新型溶瘤病毒KLS-3021在代表临床前列腺局限性（Gleason评分≤7）和局部进展性（伴有淋巴扩散）疾病的小鼠原位模型中，通过单次瘤内注射，即可诱导强大而持久的肿瘤生长抑制。其作用机制包括PH-20介导的细胞外基质降解、增强的病毒扩散、增加的免疫细胞浸润、M1巨噬细胞极化以及诱导免疫原性细胞死亡相关特征。该研究凸显了KLS-3021作为一种微创或新辅助治疗策略的转化潜力，尤其适用于适合早期局部干预的患者。
引言
随着男性人口老龄化，前列腺癌的全球发病率不断上升。低至中危患者通常采取积极监测而非立即的根治性干预，但其中一部分患者的疾病进展会显著缩短有效治疗的时间窗口。微创、影像引导的局部疗法能够实现早期干预，有望阻止疾病进展并改善患者的无进展生存结局。为满足这一临床需求，本研究评估了KLS-3021——一种编码PH-20、IL-12和可溶性PD1-Fc的新型溶瘤牛痘病毒。
前列腺癌是男性最常见的恶性肿瘤之一，其管理的一个显著特点是许多低危患者通过积极监测进行管理。然而，根治性前列腺切除术和放射治疗具有明显的侵入性，并常伴随显著的并发症风险。微创局部疗法，如高强度聚焦超声和冷冻消融，因在准确划定肿瘤边界和实现完全消融方面存在挑战而受限。因此，迫切需要一种新颖的、局部的、保留器官的治疗策略，尤其适用于不适合手术、放疗或同位素治疗的前列腺局限或局部侵袭性中低级别癌患者。
溶瘤病毒(Oncolytic Viruses, OVs)是一个整合了直接肿瘤裂解和有效免疫重编程的有前景的治疗平台。针对前列腺癌这种免疫检查点阻断疗法疗效有限的“冷”肿瘤，溶瘤病毒提供了一种在靶向肿瘤细胞的同时重塑局部免疫的合理策略。KLS-3021是临床优化版本，其编码人源PH-20透明质酸酶以降解致密的肿瘤细胞外基质(Extracellular Matrix, ECM)、IL-12以促进先天和适应性免疫激活，以及可溶性PD1-Fc以局部抑制免疫检查点信号传导而不引起全身毒性。
研究方法
本研究在两种临床相关的原位前列腺癌模型中评估了KLS-3021的治疗潜力：一种是模拟前列腺局限性疾病（仅通过体内成像系统检测到生物发光信号），另一种是模拟伴有区域淋巴结侵犯的局部进展性疾病（肉眼可见/可触及的肿瘤）。使用携带荧光素酶标记的PC-3细胞构建原位模型。肿瘤生长通过生物发光成像进行纵向追踪，并在预定时间点进行组织病理学分析。
KLS-3021在模拟前列腺局限性疾病模型中诱导持久的肿瘤生长抑制
为模拟适合积极监测的前列腺局限性疾病，将荧光素酶标记的PC-3细胞注射到裸鼠前列腺右背叶。注射9天后，选择有生物发光信号但无可触及肿瘤的小鼠。选中的小鼠接受单次前列腺内注射KLS-3021或对照制剂，阳性对照组则腹腔注射多西他赛。
全身生物发光成像显示，KLS-3021治疗组表现出快速、显著且持久的肿瘤信号抑制，其生物发光强度在所有测量时间点均显著低于两个对照组，且个体反应一致。治疗期间小鼠体重保持稳定。这些结果表明，单次前列腺内注射KLS-3021能够在信号阳性、前列腺局限性疾病模型中实现持续的肿瘤生长抑制。
组织学分析进一步证实了其疗效。治疗第3天，KLS-3021治疗组的前列腺组织显示出接近正常的组织结构，肿瘤细胞密度显著降低，而对照组则保持着高密度的细胞结构。免疫组化染色显示牛痘病毒在KLS-3021治疗组的前列腺残留肿瘤区域有局灶性存在。免疫荧光分析显示，KLS-3021治疗组中TUNEL阳性的凋亡细胞显著增加，而Ki-67阳性的增殖肿瘤细胞和CD31阳性的血管结构则显著减少。至实验终点，KLS-3021治疗组的前列腺组织显示出接近完全的肿瘤消融，而对照组则存在大量存活肿瘤区域。此外，在肿瘤引流腰淋巴结中，对照组可检测到明显的转移灶，而KLS-3021治疗组的小鼠淋巴结中则未发现肿瘤浸润迹象，表明其有效抑制了区域转移性播散。
KLS-3021在模拟局部侵袭性疾病模型中发挥强大疗效并实现持续的近完全缓解
在伴有可触及肿瘤块和区域淋巴扩散的局部侵袭性原位模型中，评估了KLS-3021的疗效。携带原位前列腺肿瘤的小鼠随机接受单次瘤内注射KLS-3021、对照制剂或多西他赛。
在对照组和多西他赛治疗组中，生物发光成像显示肿瘤随时间进展性生长，并出现前列腺外器官转移的证据。相比之下，单次瘤内注射KLS-3021诱导了显著且持续的肿瘤信号下降，在研究期间实现了近完全缓解。定量信号分析证实，在所有测量时间点，KLS-3021组的肿瘤负荷均显著低于两个对照组，且大多数动物显示出近完全或完全的信号消失。治疗期间，各组小鼠体重保持稳定，KLS-3021治疗组的小鼠体重甚至呈现增加趋势，表明其强效抗肿瘤作用不伴有明显的全身毒性。
KLS-3021通过破坏ECM结构和重编程免疫微环境来重塑肿瘤微环境
为了探究KLS-3021在直接溶瘤作用之外是否调控肿瘤微环境，在局部侵袭性模型中对治疗后第3天的肿瘤进行了分析。
苏木精-伊红染色显示，KLS-3021治疗组肿瘤细胞死亡广泛，细胞密度显著降低，而对照组肿瘤则保留了存活的肿瘤细胞和基质结构。由于KLS-3021编码PH-20透明质酸酶，阿新蓝染色显示KLS-3021治疗组肿瘤中阿新蓝阳性区域显著减少，表明PH-20介导的透明质酸富集ECM降解。伴随ECM降解，免疫组化显示牛痘病毒在KLS-3021治疗组的肿瘤实质中广泛传播，表明基质破坏促进了单次给药后高效的瘤内病毒扩散。
同时，KLS-3021治疗显著重塑了肿瘤微环境内的免疫景观。免疫组化分析显示，KLS-3021治疗组肿瘤中F4/80+巨噬细胞浸润显著增加，并伴有CXCL10表达升高。免疫荧光分析进一步显示，KLS-3021治疗诱导了巨噬细胞表型向M1型极化转变，其特征是CD86+和TNF-α+细胞群增加，而与肿瘤进展和免疫抑制相关的CD206+M2巨噬细胞显著减少。
KLS-3021在局部侵袭性模型中触发免疫原性肿瘤细胞死亡并抑制增殖
在KLS-3021诱导的广泛免疫和结构重塑之后，研究进一步探究了这些变化是否伴随具有免疫原性细胞死亡相关特征的肿瘤细胞死亡。免疫原性细胞死亡的特征是释放或暴露损伤相关分子模式(Damage-Associated Molecular Patterns, DAMPs)，可促进抗肿瘤免疫反应。
治疗后第3天，TUNEL染色显示，与对照组相比，KLS-3021治疗组肿瘤中TUNEL阳性信号显著增加，表明伴有DNA断裂的有效肿瘤细胞死亡。同时，Ki-67免疫荧光显示KLS-3021治疗后增殖肿瘤细胞显著减少。此外，KLS-3021治疗显著上调了HMGB1的表达，并且钙网蛋白表达明显上调并呈现显著的膜定位，表明细胞表面暴露促进了免疫原性信号传导和吞噬清除。
KLS-3021扩散至区域淋巴结并清除转移性肿瘤细胞
研究还评估了KLS-3021在原发性前列腺肿瘤之外的疗效。治疗后第3天，对腰淋巴结的组织学检查显示，对照组小鼠淋巴结存在广泛的转移性肿瘤浸润，而KLS-3021治疗组小鼠的淋巴结则表现出肿瘤负荷显著减少，部分淋巴结结构得以恢复。牛痘病毒免疫组化染色证实了KLS-3021治疗组小鼠淋巴结中存在病毒播散，表明病毒能从原发肿瘤有效运输至区域转移部位。与在前列腺中观察到的肿瘤消退模式一致，TUNEL染色显示KLS-3021治疗组小鼠淋巴结中肿瘤细胞死亡大量增加，而Ki-67免疫荧光则显示增殖肿瘤细胞与对照组相比显著减少。
讨论
本研究证明，新型溶瘤牛痘病毒KLS-3021在PC-3细胞构建的临床相关原位前列腺癌模型中发挥强大的抗肿瘤活性。单次局部给药可在前列腺局限和局部侵袭性疾病中均导致快速且持续的肿瘤消退。其疗效通过纵向体内成像和组织病理学分析得到确认，并显著优于系统化疗（多西他赛）。重要的是，KLS-3021不仅能控制原发性肿瘤生长，还能抑制淋巴扩散。
从机制上看，KLS-3021通过多层面策略发挥抗肿瘤作用。其初始作用包括肿瘤选择性直接溶瘤以及PH-20介导的透明质酸降解，这显著重塑了阻碍病毒传播和免疫细胞浸润的致密ECM。这种重塑为病毒在瘤内广泛分布并到达区域淋巴结创造了条件。同时，KLS-3021触发了一种强大而协调的免疫调节反应，将肿瘤免疫微环境转向促炎状态，表现为M1样巨噬细胞极化、TNF-α表达升高以及CD206+M2样巨噬细胞减少。这种促炎转变伴随着具有免疫原性细胞死亡特征的肿瘤细胞死亡，如TUNEL阳性信号增加以及HMGB1和钙网蛋白等DAMPs的释放。
本研究的转化相关性因其使用了两种原位前列腺癌模型而得到加强：一种代表早期前列腺局限性疾病，另一种代表局部进展性疾病。这些模型密切模拟了人类前列腺癌的解剖和病理进展，使得KLS-3021的评估具有临床相关性。从临床角度看，KLS-3021可能特别适用于可受益于局部微创治疗策略的前列腺癌患者群体。
本研究存在一些局限性。所有体内实验均在T细胞缺陷的裸鼠中进行，无法直接评估适应性T细胞介导的免疫反应。此外，在局部侵袭性模型研究中，KLS-3021治疗组有少量动物死亡。根据大体解剖检查，这些事件被认为与模型相关的解剖学因素一致，而非治疗相关的全身毒性。
综上所述，本研究提供了令人信服的临床前证据，表明KLS-3021通过ECM重塑、先天免疫激活和ICD诱导的协同作用，在原发性和局部侵袭性前列腺癌中发挥强大的抗肿瘤活性。这些结果表明，KLS-3021是一种有前景的下一代溶瘤免疫疗法，可作为前列腺癌的微创或新辅助治疗策略，尤其适用于不适合手术或系统治疗的老年或医学上不适宜的患者。
