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本综述系统性地阐述了在可调节流动条件下研究种植体表面多物种生物膜的实验模型构建与应用。文中介绍了双环反应器（dual-loop reactor）的设计，该装置通过将细菌培养与流体动力学暴露解耦，实现了营养供给与剪切应力的独立调控。此系统利用改良Robbins装置（Modified Robbins Device, MRD），在模拟种植体表面的钛材料上培养了六种关键口腔生物膜菌群，探究了不同流速（8-40 cm·min–1）对生物膜生物量、结构稳定性及菌群组成的影响。研究发现，流动剪切不仅显著影响生物膜总量和胞外聚合物（EPS）分泌，还改变了菌群相对丰度（如富集中间定植菌、抑制晚期定植病原体），且生物膜可被分离为易冲洗的松散层与稳定的基底层。此模型为模拟生理流动条件下生物膜的形成机制、评估抗菌涂层及植入体表面设计提供了标准化且可扩展的平台，并可为心血管移植物、导尿管等多种医疗器械的生物膜研究提供参考。
引言
自然环境中形成的生物膜通常由多种微生物组成，且常暴露于流体流动产生的强大剪切力下。传统的简单生物膜模型多基于单菌种与静态生长条件，这限制了其生理相关性。为克服这些限制，研究团队开发了一种模块化双环反应器，该装置成功将细菌培养与流体动力学暴露解耦，从而可独立控制营养可用性（从而控制细胞密度）与流速（从而控制剪切应力）。该系统还允许系统性地测试不同表面材料。为验证该装置，研究使用了一个由六种口腔生物膜关键菌种（包括早期定植菌1、中间定植菌2以及口腔病原体3等）组成的群落，并结合模拟牙种植体表面的特定粗糙度钛材料进行了实验。
研究发现，生物膜生物量、结构稳定性及物种分布不仅在静态与动态生长条件间存在显著差异，而且在不同流速下也有巨大变化。在流动条件下形成的生物膜可分为两部分：一部分极易被冲洗掉，另一部分则是更坚固的基底层。在低剪切力下，生物膜总生物量最高，但以牺牲其结构稳定性为代价。在中等剪切力下，生物膜的坚固部分胞外基质（Extracellular Polymeric Substances， EPS）相对含量最高。在最高流速下，生物膜总生物量较低，但晚期定植菌（以牙周病原体4为代表）的相对丰度最低。这与高唾液流速可降低口腔疾病风险的概念相符。该系统的未来应用将包括在明确流动条件下系统性地测试抗菌涂层或表面设计效果，为改善医疗植入物性能开辟道路。
材料与方法
研究选用了六种代表性口腔菌株，它们分别对应口腔生物膜自然定植序列的不同阶段。所有菌株均在补充了血红素和维生素K3的改良脑心浸液（Modified Brain-Heart Infusion， BHI）培养基中进行厌氧培养。实验系统的核心是一个双循环设置，包括一个用于细菌连续培养的培养循环（红色管路）和一个用于受控生物膜形成的流动循环（蓝色管路）。
培养循环使用一个100 mL玻璃容器，通过恒化器（Chemostat）原理维持稳态培养。新鲜培养基以恒定流速泵入，多余培养液通过气体流入压力排出，以保持培养体积。生物膜形成循环则利用蠕动泵，将培养液以精确控制的流速泵过一个改良罗宾斯装置（Modified Robbins Device， MRD），该装置的取样栓上固定有钛质圆盘（表面粗糙度模仿商业牙种植体），用于生物膜生长。
通过调节流速（8-40 cm·min–1），可以精确控制MRD流道内的剪切应力。系统在37°C厌氧条件下运行84小时。形成的生物膜一部分用于总生物量测定（采用结晶紫染色法），另一部分经过标准化清洗程序（用生理盐水冲洗五次）以评估其结构完整性（即“清洗后”生物膜）。生物膜的总DNA通过优化的酚-氯仿法提取。菌群组成的定量分析采用了新开发的、针对所有六种菌株RNA聚合酶β亚基基因（rpoB）的物种特异性引物进行qPCR（Quantitative PCR）。
结果
1. 流速塑造生物膜形成与内聚力
研究表明，流速对生物膜的结构特性具有深远影响。通过结晶紫染色和DNA含量测定发现，在中等流速（16 cm·min–1）下，未处理生物膜的总生物量达到最高。然而，DNA含量测定却显示，在最低流速（8 cm·min–1）下，生物膜的DNA含量（代表细胞生物量）最高。这种总生物量与DNA含量的差异表明，在中等流速下，胞外聚合物（EPS）的分泌比例较高，这有助于增强生物膜的结构稳定性。标准化清洗后，所有流速条件下均存在一个稳定的基底层，其DNA含量在不同流速间无显著差异，但中等流速下其总生物量（经结晶紫测定）显著高于其他组，进一步印证了中等剪切力能促进EPS生成并增强生物膜基质的内聚性。
2. 不同流动条件下生物膜群落及相对丰度比较
利用靶向单拷贝rpoB基因的qPCR技术，研究分析了流速对六种菌组成的生物膜群落的影响。
在最低流速下，未处理的生物膜以中间定植菌5为绝对优势（占总微生物种群的63%），晚期定植菌（P. gingivalis和6）的相对丰度也是所有流速中最高的。在中等流速下，群落分布更为均衡，早期与中间定植菌的相对丰度相近（均在19-30%之间），而晚期定植菌的比例则大幅下降。在最高流速下，中间定植菌共同占据主导地位（合计约80%），早期和晚期定植菌的丰度均受到抑制。
经过标准化清洗后，不同流速下生物膜基底层的总DNA含量相当，但物种组成呈现出一致模式：早期定植菌占比约5%，中间定植菌占主导地位（75-93%），且其比例随流速增加而上升，而晚期定植菌则随流速增加而减少。
静态培养（作为参照）形成的生物膜显示出以早期定植菌为主（合计近60%）的群落结构，与流动条件下形成的生物膜存在根本性差异，突出了流动在塑造生物膜菌群组成中的关键作用。
3. qPCR体系优化与性能
为确保对多物种生物膜中所有成员（尤其是高GC含量的7）的准确定量，研究团队优化了qPCR方案。通过将预变性时间延长至15分钟，并在反应体系中添加2%的二甲基亚砜（DMSO），有效解决了该菌DNA在qPCR初期产生高背景荧光的问题，并提高了扩增效率和重复性。所有物种特异性引物对的扩增效率在81%至102%之间，线性动态范围覆盖五个数量级（10–5至 10–9mg DNA），确保了定量结果的可靠性。
讨论
本研究成功开发并验证了一个双循环生物膜培养系统，能够独立控制生物膜形成的流体动力学条件与反应器内的培养参数。与传统的静态模型或耦合式动态系统（如CDC生物膜反应器或串联式MRD-恒化器系统）相比，该系统通过解耦设计克服了流速与培养条件相互制约的限制。计算表明，在所用流速下（8-32 cm·min–1），MRD内的流动处于层流状态（雷诺数Re ≈ 24-94），这与生理性的龈沟液流动条件相符。
研究证实，流速（剪切应力）深刻影响着多物种口腔生物膜的结构与组成。低流速促进了总生物量（尤其是细胞生物量）的积累，但形成的生物膜结构松散；中等流速虽然细胞生物量略低，但促进了EPS的分泌，形成了总生物量最高且结构最稳定的生物膜；高流速则抑制了生物膜的整体生长。在物种层面，低流速有利于中间定植菌及晚期病原体的定植，而增加流速则抑制了晚期病原体的比例，这与高唾液流速可能降低口腔疾病风险的观点一致。所有生物膜都存在一个稳定的、由中间定植菌主导的基底层，其成分在不同流速下相对稳定，这对理解清创术后生物膜再生的潜在风险具有重要意义。
该模型的优势在于其高度的灵活性和可扩展性。它不仅能精确模拟口腔环境，研究种植体相关感染，其独立控制流动与培养参数的核心设计也使其能适用于从单物种工业生物膜到多微生物感染的广泛研究。通过调整流速和培养条件，该系统可模拟从低剪切力的骨科植入物到高剪切力的血管移植物或导尿管等多种临床场景，为在受控的、生理相关的条件下系统性评估新型抗菌涂层或植入物表面设计提供了强大工具。未来的研究可结合更先进的成像技术（如扫描离子电导显微镜SICM），并利用系统的灵活性研究非均匀流动模式或剪切脉冲对生物膜的影响，从而进一步加深对复杂生物膜行为的理解。
