编辑推荐：
本研究表明，纳拉萨菌素作为一种离子载体，能够选择性调节肉牛瘤胃和盲肠的特定细菌类群，而非导致整体微生物群落结构的广泛破坏，这为通过靶向调控微生物组改善反刍动物饲料效率提供了新的科学依据。
1 引言
高能饲料，尤其是富含淀粉的日粮，常导致肉牛瘤胃中短链脂肪酸(SCFA)增加，这可能引起瘤胃pH值暂时下降，并导致如瘤胃酸中毒等代谢问题，进而影响采食量。瘤胃酸中毒是奶牛和肉牛面临的主要健康挑战之一。因此，大量研究聚焦于预防或缓解酸中毒以提升肉牛性能。内洛尔牛(Bos indicus)是巴西及全球热带亚热带地区的主要肉牛品种，具有与欧洲牛(Bos taurus)不同的生理代谢特性，包括饲料效率、瘤胃发酵模式及宿主-微生物组互作。因此，将其视为微生物组研究中一个独特的生物模型至关重要。
饲料添加剂，如离子载体，被广泛研究用于调控瘤胃酸化和提升肉牛性能。其主要机制是调控革兰氏阳性瘤胃细菌的生长，包括产乳酸菌，通过改变敏感微生物的跨膜离子梯度，进而改变微生物活性和发酵终产物，例如增加丙酸产量并改善饲料效率。
纳拉萨菌素是已证实可改变瘤胃发酵动态的离子载体之一，可导致血浆代谢物变化，如提高葡萄糖水平、降低尿素浓度，从而对动物性能产生积极效果。研究表明，在日粮中添加纳拉萨菌素可增加瘤胃丙酸浓度、降低乙酸/丙酸比例，并提高总SCFA浓度，同时提升干物质采食量、平均日增重和终末活重。尽管多项研究记录了纳拉萨菌素等对瘤胃发酵参数的影响，但其对瘤胃微生物群落结构的直接影响信息仍然有限，且很大程度上是从莫能菌素的研究中推断而来。此外，纳拉萨菌素对盲肠微生物群的潜在影响（盲肠是后瘤胃发酵的关键场所）在很大程度上尚未被探索。
鉴于瘤胃和盲肠之间的功能差异，以及对纳拉萨菌素跨胃肠道区室效应信息的缺乏，有必要对这两个部位进行全面评估。本研究假设纳拉萨菌素会对两个区室的特异性细菌类群施加选择压力，导致区室特异性的微生物组成变化，而不会引起整体群落多样性的大规模破坏。因此，本研究旨在利用16S rRNA基因测序技术，表征补充纳拉萨菌素的肉牛瘤胃和盲肠细菌群落特征。
2 材料与方法
2.1 动物与实验设计
动物护理遵循动物使用伦理委员会(CEUA)指南，并获得圣保罗州立大学(UNESP)动物使用伦理委员会的批准。研究在巴西UNESP德拉塞纳校区实验肉牛场进行。64头内洛尔公牛被随机分配到16个栏中，采用完全随机区组设计，以初始体重作为区组标准。试验持续112天，之后所有动物在商业屠宰场屠宰。
动物先适应设施并饲喂提夫顿干草7天以标准化瘤胃微生物群。随后，动物在每个区组内随机分配到以下处理之一：0 ppm（对照）或20 ppm纳拉萨菌素。添加剂从适应期开始持续添加直至屠宰。
2.2 管理与饲养
动物抵达后进行称重、驱虫和疫苗接种。饲养在部分混凝土地面的栏中，每栏4头动物，通过自动饮水器自由饮水。每日饲喂三次。试验包括一个14天的适应期，采用阶梯式协议，包含三种适应日粮，最终肥育日粮包含87%的精料。日粮根据大型反刍动物营养系统(LRNS)第2级进行配制，并提供ad libitum。
2.3 DNA提取、PCR扩增与文库构建
瘤胃和盲肠内容物在屠宰后收集，并于-80°C保存。总DNA通过机械破碎和酚氯仿提取法获得。使用针对16S rRNA基因V4高变区的通用引物进行PCR扩增。扩增产物经凝胶纯化后，在Illumina MiSeq平台上进行测序。
2.4 序列处理与分析
原始序列使用mothur进行质量控制和分析。包括序列筛查、比对、去除嵌合体和分类学分配。序列按97%相似性聚类为操作分类单元(OTU)。样本通过二次抽样至最小序列数进行标准化。使用Bray-Curtis和Jaccard相异度进行β多样性分析，并使用NMDS进行可视化。同时，在属水平构建微生物共现网络，以识别细菌属间的相关性模式。
2.5 统计分析
所有分析在R中进行。使用Shannon指数和Chao1指数评估α多样性，组间比较采用t检验。使用PERMANOVA分析β多样性的组间差异。使用Wilcoxon秩和检验比较门水平相对丰度的差异，并对p值进行FDR校正。
3 结果
3.1 微生物多样性与丰富度
瘤胃的细菌多样性和丰富度均高于盲肠，与处理无关。纳拉萨菌素补充未影响瘤胃或盲肠的Shannon多样性指数。然而，纳拉萨菌素降低了瘤胃的Chao1丰富度指数(p?=?0.032)，但对盲肠无显著影响。这些结果表明纳拉萨菌素对物种丰富度有选择性影响。
3.2 群落结构与组成
基于Bray-Curtis和Jaccard相异度的β多样性分析显示，无论瘤胃还是盲肠，处理组间的整体群落结构均无显著差异。这表明纳拉萨菌素并未引起微生物群落的广泛结构重组。
在门水平上，纳拉萨菌素补充与瘤胃中硬壁菌门(Firmicutes)的减少以及拟杆菌门(Bacteroidetes)的伴随增加相关。相反，硬壁菌门在盲肠中占主导地位，且纳拉萨菌素显著增加了该门的相对丰度，尤其是梭菌目(Clostridiales)成员。
3.3 微生物共现网络分析
在瘤胃中，对照组的微生物网络更为复杂，包含40个显著相关性。纳拉萨菌素处理导致网络简化，总相关性减少至30个，且负相关占比略有增加。这表明纳拉萨菌素不仅改变了特定类群的丰度，还减少了属间的相互依赖关系。
在盲肠中，情况相反。纳拉萨菌素处理组的网络连接性略有增加，从19个相关性增至23个，并且正相关性占比更高。这表明在盲肠中，纳拉萨菌素可能促进了更具合作性、更稳定的微生物群落结构。
4 讨论
本研究首次全面评估了纳拉萨菌素对内洛尔肉牛瘤胃和盲肠微生物群的影响。瘤胃中硬壁菌门的减少和拟杆菌门的增加与离子载体靶向革兰氏阳性菌的作用机制一致。然而，整体群落结构的稳定性表明，微生物群内可能存在功能冗余以维持发酵能力。
盲肠表现出独特的反应模式。硬壁菌门（尤其是梭菌目）的增加，可能是由于瘤胃发酵改变后流入盲肠的食糜成分发生变化所致。盲肠微生物网络的复杂性增加和正相关主导，暗示纳拉萨菌素可能通过改变上游消化过程，间接促进了盲肠中一个更专业化、更合作的微生物生态系统的形成。
共现网络分析揭示了纳拉萨菌素重塑微生物生态相互作用的深刻影响。在瘤胃中，它简化了网络，可能降低了生态系统的稳健性；而在盲肠中，它似乎增强了网络的合作性。这种区室特异性的网络重塑，是理解离子载体如何通过改变微生物互作而影响整体消化效率的关键。
5 结论
纳拉萨菌素对特定细菌种群（如硬壁菌门，尤其是梭菌目）具有选择性效应，但并未显著改变整体微生物多样性。这种效应可能与瘤胃丰富度降低以及盲肠微生物群的改变有关，可能通过偏好某些发酵途径而影响饲料效率。此外，纳拉萨菌素通过减少属间相互作用的复杂性，重塑了瘤胃微生物生态。然而，需要进一步研究来理解这些微生物变化的功能意义及其如何转化为生产效益。本研究为理解离子载体在反刍动物不同胃肠道区室的差异作用提供了新的视角。
