《Frontiers in Microbiology》：Enhancing biological nitrogen fixation in rice paddy ecosystems: challenges, opportunities, and sustainable strategies
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这篇综述聚焦于如何利用微生物的生物固氮（BNF）过程，为水稻（Oryza sativa）生产提供一个可持续的替代性氮源，以应对过度依赖合成氮肥带来的氮利用率低、环境污染和土壤退化等问题。文章系统梳理了稻田BNF的定量方法、调控因素（特别是氮肥的抑制作用）及增强策略（如秸秆还田、选育耐铵固氮菌、基因工程改造等），为发展低投入、环境友好的水稻生产体系提供了重要见解。
在追求粮食安全与农业可持续发展的十字路口，如何减少对合成氮肥的依赖成为关键。合成氮肥虽大幅提升了水稻产量，却也带来了氮利用效率低下、环境污染和土壤健康恶化等一系列问题。生物固氮（BNF）——由固氮微生物将大气中的氮气（N2）转化为植物可利用的铵（NH4+）——提供了一种可持续的、补充性的氮源，其供氮缓慢且与植物需求同步。然而，在当代高产稻田中，高强度的氮肥施用强烈抑制了BNF，形成了一个看似无解的矛盾：为了高产必须施氮，而施氮又破坏了可减少氮肥依赖的生物过程。本综述旨在整合当前知识，探索在现实施肥条件下增强稻田BNF的可行路径。
1 引言
氮是决定水稻生产力的关键元素。然而，全球每年施用的氮肥超过1亿吨，其中亚洲稻田生态系统占很大比例，而稻田的氮利用效率通常低于50%，超过一半的氮通过淋溶、挥发或反硝化作用损失。这不仅增加农民成本，还导致地下水污染、水体富营养化和温室气体氧化亚氮（N2O）排放。长期过量施氮还会导致土壤酸化、有机质耗竭和微生物群落紊乱，进而降低生物多样性。因此，发展可持续的氮管理策略迫在眉睫。BNF这一古老的自然过程，在历史上支撑了数百年不施化肥的水稻生产。淹水、富碳的稻田环境为固氮微生物创造了有利的生态位。研究表明，稻田的固氮活性显著高于其他作物系统。但BNF对外源氮输入高度敏感，当施氮量超过125 kg N ha?1时，其活性下降超过80%。为了维持高产，亚洲稻田的氮肥投入常超过200 kg N ha?1，这严重制约了BNF潜力的发挥。打破这一悖论，需要在维持产量的同时，探索如何在施肥条件下维持甚至增强BNF。
2 稻田土壤环境及其固氮微生物群落
理解稻田BNF，首先要认识淹水土壤独特的环境异质性和其中固氮微生物群落的生态组织。淹水为水稻栽培带来了连续供水、土壤pH渐变等优势，并在无氮肥的农业中维持了土壤氮肥力。淹水在表层下创造了厌氧条件，导致稻田中存在五个不同的BNF微环境，受物理化学性质、光照和能量供应影响。这包括：(1) 有光、好氧的淹水层；(2) 有光、氧化的薄表土层；(3) 无光、厌氧的还原性亚土层；(4) 水稻植株本身（根际、叶际）；(5) 犁底层。这些多样化的微环境共同支撑了稻田的BNF和养分循环。
固氮微生物，包括共生、联合和自生固氮菌，存在于稻田系统的多个生态位。分子生物学研究表明，稻田中的固氮微生物群落具有高度的分类学异质性，不同环境条件下优势类群不同。植物相关的固氮微生物，特别是与水稻根系相连的，常是现代集约化水稻田中主要的BNF执行者。研究揭示了根际和土体中多样的固氮菌群落，包括在淹水还原条件下占优势的铁还原菌属，如Anaeromyxobacter和Geobacter。同时，表层土壤富含蓝细菌固氮菌，而内生固氮菌则定殖于水稻根、茎、叶中，其活性和群落结构因基因型和发育阶段而异。有趣的是，固氮微生物多样性和群落组成的功能重要性非常显著。研究发现，固氮潜力与固氮酶基因nifH的丰度并无显著相关性，而与群落组成、多样性及土壤钼、总氮、总磷、有机碳含量等环境因子关系更密切。这意味着，不仅仅是微生物的数量，其种类构成和彼此间的生态互动更能调节固氮效率。此外，农业实践如生物炭添加、秸秆还田等，能显著改变固氮微生物群落结构和功能潜力。这些发现强调，有效的固氮菌接种剂必须考虑到土著固氮菌的多样性和群落组装规则，选择能融入当地群落的菌株，而非试图取代它们。
3 稻田生物固氮的测量方法
研究BNF，必须准确定量其速率。测量方法的差异并非技术细节，而是深刻影响所报告的固氮速率和空间模式推断的关键。根据原理和假设的不同，主要有五类方法，可分为间接和直接定量。最常用的间接方法是乙炔还原法，其他包括自然丰度15N法、15N同位素稀释法和氮平衡法等。这些间接方法固有的不确定性源于其对不准确转换因子的依赖，或难以充分核算各种氮源和损失途径。最直接的BNF测定方法是15N2气体标记法。该方法无需转换因子，且不受外源氮影响，可准确测量BNF。但其挑战在于需长期维持系统密闭性，并使生长室环境（如CO2浓度、氧气、温度、光照）尽可能接近田间条件，且高纯度、高丰度15N2气体成本高昂。
在中国，研究者开发了用于田间应用的智能原位密闭植物生长控制系统。该系统可自动调节内部温度、CO2浓度、水位和氧气浓度，实现了对整个水稻生长季BNF的高精度量化。基于此系统的研究表明，BNF在水稻生长季内持续进行。然而，这种密闭箱系统虽然提供了高精度的过程级测量，但不可避免地改变了气体扩散、小气候和植物-微生物相互作用，因此其结果更适合解释为BNF过程和相对空间模式的稳健估计，而非整个田块BNF预算的直接代表。同时，密闭测量无法反映BNF的时间动态变化（如不同生育期或昼夜循环），未来需要整合长期、多时相的观测。
4 稻田生物固氮的总量与空间热点
BNF在稻田土壤中具有空间异质性和垂直分层性，反映了光照、氧化还原电位、底物供应和微生物群落组成的强烈梯度。主导的BNF系统包括栖息于淹水层和表土层的光合固氮微生物（主要是蓝细菌），以及位于根际和还原性亚土层的异养和铁还原固氮菌。早期基于乙炔还原法或氮平衡法的估算认为，未施肥稻田的季节性BNF可达40–60 kg N ha?1，蓝细菌和异养细菌贡献相当。然而，近期的原位15N2标记研究通常报告了较低的固氮速率，在未施肥系统中一般为1至约22 kg N ha?1。这种差异可能源于方法学的不同，也可能反映了长期施肥导致的BNF能力真实下降。
识别和理解BNF热点对机理研究和田间管理都至关重要。基于15N2示踪实验，新固定的氮强烈富集在水-土界面：在淹水稻田系统中，55%与土壤结合的固定15N在0–1 cm的表层土壤中回收，那里是光合蓝细菌和其他表面生物膜的主导区域。更近期的结合15N-DNA-SIP和NanoSIMS的研究证实，土壤中生物固氮的94.08%可在0–0.5 cm土层中回收，且Nostocales和Stigonematales蓝细菌是该光照表层生态位的主要活性固氮菌。多项研究综合表明，46–94%的土壤BNF发生在0–1 cm土层，而仅有6–54%发生在亚土层。这种比例的年间变异可能与不同年份的温度和光照条件差异有关，因为表层光合固氮菌对两者都高度敏感。在表层以下，根际和还原性亚土层也是异养和铁还原固氮菌的重要热点。近期基于SIP的研究发现，Anaeromyxobacter和Geobacter是缺氧、铁还原层中的优势活性固氮菌，其活性可被铁添加进一步刺激。然而，当季水稻作物所利用的BNF（包括内生固氮和从土壤吸收的固定氮）仅占总固氮量的1–25%，其余75–99%保留在土壤中。这表明内生固氮菌并非稻田BNF的主要贡献者。固定氮从微生物库向水稻植株的转移速率，主要受微生物周转率、有机氮矿化时间以及氮释放与作物需氮期同步性的控制。快速的微生物固定和缓慢的生物量周转会将大部分固定氮封存在微生物和土壤有机库中，而延迟的矿化常导致与植物氮吸收高峰不匹配，限制了其农学效益。因此，评估BNF对当季作物的贡献，不仅需要量化固氮总量，还需理解其释放动态。优化管理措施以促进固定氮在作物关键需氮期释放，对于最大化BNF的农学价值至关重要。
需要强调的是，这些定量热点估算主要源于中国连续淹水稻田的密闭箱原位15N2标记研究。它们在不同稻作国家、土壤质地、施肥历史和水管理下的代表性仍不确定。此外，时间尺度整合是量化BNF的主要挑战，固氮酶活性和N2固定速率可在昼夜光周期、氧化还原瞬变、施肥和灌溉管理影响下大幅波动。
5 合成氮输入对生物固氮的调控：抑制机制与缓解策略
合成氮肥在稻田系统中扮演着双重角色：农学上不可或缺，生物学上却抑制BNF。大量研究证实了合成氮肥对BNF的抑制作用。这是因为固氮微生物除了通过BNF从大气获取氮外，也能利用土壤中外部有效的氮源。考虑到BNF高昂的能量成本，当有外部氮可用时，这些微生物会优先利用。盆栽试验进一步证实了这一趋势，无论是在土体、根际还是苔藓生态系统中，自生固氮在低氮环境中往往高于富氮条件。15N2示踪实验发现，在125–250 kg N ha?1的施肥水平下，N2固定速率下降了81–86%。一项针对拉丁美洲主要生物群系的荟萃分析显示，试验性氮添加平均使自生BNF降低了30%。
国际上在阐明这种抑制效应的机制方面取得了显著进展：高浓度的NH4+（>60 mg kg?1）通过抑制nif基因表达和干扰电子传递链来抑制固氮酶活性。然而，添加碳源可以在一定程度上缓解合成氮肥对BNF的抑制。长期秸秆还田可使BNF活性恢复高达68%。实验室实验表明，施用80 kg N ha?1显著降低了BNF，但当同时施用6 t ha?1秸秆时，未观察到BNF降低。基于荟萃分析，氮添加抑制BNF，但这种抑制效应随土壤有机碳（SOC）增加而减弱，表明SOC是调节固氮对氮富集响应及陆地碳氮耦合的关键。可溶性碳输入刺激异养固氮菌增殖，高碳氮比的秸秆可能比低碳氮比的秸秆更有效地促进异养细菌固氮。同时，施用可溶性碳底物可增强微生物固氮，有效降低土壤铵浓度，从而缓解其对固氮酶活性的抑制，为BNF进行创造有利条件。相比之下，蓝细菌等光合固氮菌对外源碳输入响应有限。然而，不同有机改良剂对BNF的影响差异很大。目前，有机物料生化特性与BNF激活阈值之间的定量关系尚未解决，缺乏精准调控的理论基础。
耐铵固氮菌接种剂有望在施肥制度下增强BNF。不同固氮类群对氮输入的响应不同。例如，已分离出耐铵固氮菌株如Pseudomonas stutzeri A1501，其nif基因簇具有独特的氮调控元件。单细胞固氮蓝细菌C. watsonii在高硝酸盐浓度下暴露两周后仍能维持生长和固氮活性。然而，当前研究仍有限，因为抗性菌株的发现主要依赖传统的培养方法，漏筛率高。结合15N稳定同位素探测与高通量测序，可以更精细地解析稻田中的活性固氮菌，为靶向分离和培育耐铵菌株提供指导。
另一种潜在策略是通过基因工程改造固氮菌，使其丧失同化环境铵的能力，从而迫使它们向外界排泄铵离子。研究发现，敲除nifL基因并组成型表达nifA基因的工程化Azotobacter chroococcumHKD15，使小麦增产60%，尿素用量减少85 kg ha?1，并提高了植株氮含量，且不影响土壤微生物种群。在Azotobacter vinelandii中，联合突变使固氮去调控并减弱铵再同化，驱动了毫摩尔水平的NH4+排泄。在与禾本科作物更直接相关的联合固氮菌中，Azorhizobium caulinodans已被改造，使其固氮和NH4+释放可外部控制，最小化代谢负担和脱靶氮损失。光合固氮菌也在开发中：表达铁唯一固氮酶的工程化Rhodopseudomonas palustris在过量铵条件下保持活性，并作为生物肥料促进作物生长。这些研究表明，解除铵同化和转运、将固氮酶活性与植物信号耦合、选择适应淹水氧化还原动态土壤的底盘，是设计适用于水稻的泌铵接种剂的关键设计原则。在真实稻田系统中进行田间规模验证，量化向水稻的氮转移、在复杂群落中的持久性/竞争性以及氨损失的遏制，是关键的下一步。同时，工程化泌铵固氮菌的田间应用受到生态风险的限制，必须加以解决才能实现可持续利用。
6 其他因素对稻田生物固氮的影响
在稻田生态系统中，BNF还受到氮和碳之外的多种环境和营养因子的共同调控。磷、铁、钼等必需营养元素对维持固氮活性至关重要。磷是ATP生物合成、核酸形成和根-微生物互作所必需的，缺磷显著限制固氮酶功能，而施磷可通过支持能量代谢和刺激根际过程来增强BNF。铁是固氮酶和关键电子载体的结构核心，其在淹水土壤中的生物有效性与氧化还原动态密切相关。钼虽是微量元素，却是固氮酶催化中心不可或缺的，其在酸性土壤中易被固定而有效性低。使用15N2示踪实验发现，在不施氮肥的水稻-始成土系统中，施用钼显著增强了BNF。此外，土壤pH通过对固氮微生物群落组成和固氮酶活性的关键影响，近中性条件通常比酸性土壤更有利于固氮。
土壤水分状况、氧化还原电位和氧气有效性进一步塑造了BNF的时空动态。淹水迅速建立还原、低氧条件以保护固氮酶，而中期晒田或间歇灌溉则通过提高Eh和氧气渗透来抑制固氮，尽管复水可能诱发固氮活性的补偿性激增。在这些波动条件下，蓝细菌和异养固氮菌不仅在优势栖息地（光照表层生物膜/周丛生物 vs. 团聚体和孔隙内的还原微点）上不同，其底层调控逻辑也不同。蓝细菌主要通过空间分离（异形胞限制O2扩散并增强O2清除）和/或时间分离（在非异形胞类群中进行暗期固氮）来协调产氧光合作用与氧敏感固氮酶，ATP和还原力最终由光合电子传递和碳水化合物向固氮细胞的转移提供。相比之下，异养固氮菌主要受电子供体（活性碳）、呼吸需求和微氧/厌氧避难所获取的限制；在结构化基质内部，扩散限制可创造低氧微区，使得即使周围大环境有氧，固氮酶活性仍能进行。在细胞水平，一些好氧/微好氧异养菌还通过高呼吸耗氧和固氮酶蛋白水平的“构象保护”来缓冲瞬时的氧气侵入。它们的电子供应架构也可依赖膜 redox 泵来生成可变氧化还原和底物状态下固氮酶所需的低电位电子。这些差异共同支持了一个关于稻田BNF的氧化还原-光生态位框架：有光-好氧表层利于蓝细菌策略，而还原性微点/团聚体和根际口袋则利于由活性碳和扩散受限氧气支持的异养固氮；因此，干湿交替预计不仅会改变BNF量级，还会改变优势固氮功能群及其关键控制点。
水稻栽培及其特定基因型也是塑造固氮微生物群落和调控BNF的因素。研究发现，水稻栽培刺激了整体BNF，并增加了异养固氮相对于光合固氮的优势。水稻根系分泌物为固氮细菌提供了必需的碳氮源。此外，水稻植株吸收氮降低了土壤氮浓度，促进了根周异养固氮。研究显示不同水稻品种间的BNF存在显著变异，栽培品种高于野生种。研究发现，粳稻品种W23的BNF为22.3 kg ha?1，而杂交籼稻IIY为38.9 kg ha?1，表明水稻品种类型对BNF量级有实质性影响。通过基因改造水稻增加芹菜素等化合物的产生，可刺激固氮菌生物膜形成、促进定殖并增强BNF，最终在限氮条件下提高谷物产量。
土壤物理结构是一个常被忽视但至关重要的BNF调节因子。土壤团聚、孔隙大小分布和扩散限制等特征通过塑造氧化还原梯度和创造空间异质微环境，强烈控制氧气有效性。这些物理属性决定了固氮微生物群落间的生态位分离程度，使得氧敏感固氮酶活性能在受保护的微点中持续进行。在淹水稻田中，团聚体和表面生物膜内的扩散限制促进了有利于异养和光合固氮菌的低氧微区形成，而在亚土层，孔隙连通性和团聚体稳定性则支配着支持铁还原等厌氧固氮菌的厌氧避难所的持久性。不同质地的土壤具有固有的团聚稳定性、孔隙度和气体传导性差异。尽管其作用基础，土壤物理属性很少被明确纳入BNF的概念或定量框架中。实际上，土壤物理性质可能与其他因子相互作用，共同调控BNF。一项荟萃分析报告，较高的土壤容重和粘壤土含量，尽管理论上通过增加可栖息土壤空间和创造低氧条件而有利于固氮，但不能完全解释观察到的固氮下降。这些属性虽然增强了固氮对变暖、干旱和多重环境胁迫的响应，但也解释了固氮对变暖、增雨和氮沉降响应中2–56%的下降，表明其效应高度依赖于情境，由尚不明确的机制驱动。因此，将土壤物理结构视为与化学、生物因子并列的共同决定因子，对于从机理上理解稻田农业生态系统中表层和亚表层生态位的固氮空间格局至关重要。
7 增强水稻系统生物固氮的综合策略
“碳氮协同”路径：优化氮肥形态（如控释肥）与策略性有机碳添加（如秸秆）相结合。如第5节所述，过量矿质氮抑制BNF；因此，优化施肥量、时期和位置可缓解这种抑制。有趣的是，化学氮肥对BNF的抑制在亚土层强于0–1 cm表层，表明固氮菌对氮抑制的敏感性存在生态位特异性差异。这种抑制可能通过优化施肥管理以及选择增效肥料（如控释产品和抑制剂）来缓解，因为后者可减少早期/大量的矿质氮峰值。然而，这些推测需要进一步实验验证。
“植物-微生物伙伴关系”路径：将具有优化根系性状的水稻品种与兼容的、本地适应的微生物接种剂相结合。水稻通过根系调节氧气梯度、释放光合产物为异养固氮菌提供燃料，品种间的遗传变异通过影响根系构型、泌氧和分泌物组成来影响BNF。某些水稻基因型更擅长招募和维持有益的固氮微生物群落。不同的耕作措施对根际和土体的固氮微生物群落产生不同影响。例如，与传统翻耕相比，强度较低的耕作方式减少了自生固氮菌的相对丰度，并破坏了群落多样性和网络结构。
“水分-氧化还原调控”路径：利用水分管理动态塑造好氧/厌氧界面，以利于有益的固氮功能群。水分管理调节稻田土壤的氧气有效性和氧化还原电位，连续淹水利于专性厌氧菌和光合蓝细菌。尽管淹水稻田仍是亚洲主要的水稻生产系统，但节水或好气条件正变得越来越普遍。除非另有说明，本综述引用的许多经典BNF文献都源于连续淹水系统。然而，新证据表明，在非淹水或间歇淹水条件下，固氮微生物群落组成和BNF速率存在显著差异。例如，干湿交替系统常显示异养固氮菌丰度增加，但蓝细菌活性降低。有研究发现，随着稻田土壤由干变湿，固氮酶活性增加，但当由湿变干时则下降。类似地，水稻根际固氮酶活性在适度水深、少量氮磷输入和土壤表施尿素时最大化，但在浅水中施用尿素丸或长期深淹水时被强烈抑制。与连续淹水相比，间歇灌溉可能使总BNF基本不变，但通过水分驱动的固氮微生物群落变化，将固定的氮从表层和土体重新分配到水稻根部和地上部。连续淹水下的秸秆还田可使总BNF相对于间歇灌溉增加一倍以上，主要是通过增加异养固氮菌的丰度和活性。尽管如此，不同水分管理制度下可靠的、可比的BNF估算仍然稀缺，整合这些日益普及的节水系统的研究结果，对于现
