GLP1R与GIPR在牙周膜干细胞自我更新及多向分化中的促进作用及其分子机制

《Cellular & Molecular Biology Letters》：The promoting roles of GLP1R and GIPR in stemness maintenance and multiple lineage-specific differentiation of PDLSCs

本文系统探讨了牙周膜干细胞（PDLSCs）在炎症等应激条件下功能受损的机制，并首次揭示了GLP-1受体（GLP1R）与GIP受体（GIPR）在维持PDLSCs干细胞特性及促进其成骨、成脂、成软骨和成神经等多向分化中的关键作用。研究发现，GIPR激活通过MAPK/ERK信号通路增强细胞增殖，而GLP1R则通过抑制IFIT蛋白介导的翻译阻遏来促进分化相关蛋白的合成。体内外实验及临床数据均证实，GLP1R/GIPR双重激动剂能有效促进牙周组织再生，为牙周炎的治疗提供了新的靶点和策略。

　　

引言

牙周炎是一种导致牙周组织进行性破坏的慢性炎症性疾病，是成人牙齿丧失的主要原因。牙周膜干细胞（PDLSCs）因其多向分化潜能和修复牙槽骨、牙骨质及牙周韧带的能力，在牙周再生治疗中展现出巨大潜力。然而，慢性炎症会显著损害PDLSCs的增殖、干细胞特性及成骨能力，从而限制其治疗应用。因此，在炎症条件下寻找能够恢复PDLSC功能的信号通路具有重要意义。胰高血糖素样肽-1受体（GLP1R）和葡萄糖依赖性促胰岛素多肽受体（GIPR）是主要在代谢疾病中研究的代谢激素受体。除其在胰岛素分泌和葡萄糖稳态中的经典作用外，新证据表明肠促胰岛素信号在多种细胞类型中具有抗炎、抗氧化和细胞保护作用。尽管取得了进展，GLP1R和GIPR在PDLSCs中的作用仍不清楚。本研究旨在系统探究GLP1R和GIPR在PDLSCs中的表达模式、在炎症微环境下的调控及其对PDLSC增殖、干细胞特性和成骨分化的影响。

材料与方法

本研究收集了健康正畸患者和牙周炎患者的牙周膜（PDL）组织，分离培养PDLSCs。通过暴露于电子烟提取物、脂多糖（LPS）、酒精、高糖等多种口腔常见应激源，评估GLP1R和GIPR的表达。通过siRNA敲低、过表达以及单/双受体激动剂处理，研究受体功能。采用CCK-8、克隆形成、细胞周期分析评估细胞增殖；通过茜素红S染色、油红O染色、阿利新蓝染色及免疫荧光评估成骨、成脂、成软骨及成神经分化能力。利用RNA测序（RNA-seq）、染色质免疫沉淀测序（ChIP-seq）和RNA免疫沉淀测序（RIP-seq）解析下游信号通路和RNA-蛋白质相互作用。通过免疫沉淀研究IFIT相关翻译起始因子的蛋白质合成调控。在动物实验中，对野生型和GLP1R/GIPR双敲除牙周炎小鼠移植CRISPR-Cas9 mCherry标记的PDLSCs并施用受体激动剂，通过组织学和谱系追踪评估疾病严重程度和PDLSCs命运。最后，对150名牙周炎患者（其中74人长期使用GLP1R或GLP1R/GIPR双重激动剂）进行问卷调查，评估其牙周状况。

结果

1. 1.
   多种应激条件下PDLSCs中GLP1R和GIPR表达下调
   在香烟、电子烟、LPS、酒精、高糖等应激条件下，PDLSCs中GLP1R和GIPR的表达显著下调，同时细胞内cAMP、Ca²⁺水平和PKA活性也发生显著变化。从牙周炎患者和小鼠模型中分离的PDLSCs也显示GLP1R和GIPR表达降低。
2. 2.
   GIPR通过MAPK/ERK信号通路增强PDLSCs的细胞增殖
   功能实验表明，GIPR敲低削弱PDLSC增殖能力，而GIPR激动剂（GIPRA）和双受体激动剂（2GRA）能显著促进其增殖。RNA-seq和GSEA分析发现GIPR激活富集了MAPK/ERK信号通路。进一步实验证实，ERK1/2抑制剂能有效阻断GIPRA诱导的细胞生长。ChIP-seq显示，GIPRA处理后，p-ERK1/2在_MKI67、_PCNA和_CCND3等细胞周期相关基因启动子区域的结合增强，且ERK1/2抑制也会降低p-CREB、TCF4和p-STAT3的基因组占据，表明ERK1/2是GIPR促增殖作用的核心枢纽。
3. 3.
   GLP1RA促进PDLSCs的多向分化
   分化实验表明，GLP1R敲低抑制PDLSCs的成骨、成脂、成软骨和成神经分化潜能，而GLP1RA和2GRA则能显著增强其多向分化能力。有趣的是，在分化系统中，GIPRA处理组的PDLSCs仍高表达STRO-1、CD146和波形蛋白等间充质干细胞标志物，提示GIPR可能有助于在分化过程中维持PDLSCs的自我更新能力。
4. 4.
   GLP1R/IFIT轴通过翻译抑制削弱分化相关蛋白合成
   RNA-seq发现，在GLP1R敲低的PDLSCs分化体系中，干扰素诱导蛋白（IFIT1/2/3）及相关基因（_IRF9、_IFI44等）表达显著上调，而GLP1RA和2GRA则抑制其表达。尽管_COL1A1、_BGLAP（OCN）、_RUNX2等经典分化标志基因在转录水平无明显变化，但其蛋白表达受GLP1R敲低抑制，并被GLP1RA恢复，提示存在转录后或翻译水平调控。机制上，GLP1R敲低导致IFIT1/2/3表达上调，这些蛋白与翻译起始因子eIF3C/E相互作用，并削弱eIF3C与核糖体蛋白RPS3的结合，从而抑制分化相关mRNA的翻译。RIP-seq进一步证实，GLP1R敲低后，IFIT1在_SPP1、_FGF18、_COL1A1、_BMP2、_MMP14等成骨相关基因的5‘UTR区域结合增强，导致其蛋白翻译受阻。
5. 5.
   GIPRA和GLP1RA在体内促进PDLSCs介导的牙周再生
   在野生型和GLP1R^?/?/GIPR^?/?双敲除牙周炎小鼠模型中，单独使用GLP1RA、GIPRA或2GRA能轻度改善牙周炎症状，但在双敲除小鼠中无效。移植外源性PDLSCs能显著减轻牙周组织破坏，在此基础上联合使用GLP1RA或GIPRA能进一步显著促进牙周再生。利用CRISPR-Cas9构建的谱系追踪小鼠PDLSCs显示，2GRA处理能增加CD146（增殖标志）及RUNX2（成骨）、CD29（成软骨）、UCP1（成脂）阳性细胞，同时降低IFIT1表达。
6. 6.
   临床数据支持GLP1R/GIPR激动剂对牙周炎的改善作用
   对150名非糖尿病的牙周炎患者分析发现，接受GLP1R或双受体激动剂（如司美格鲁肽、利拉鲁肽、替尔泊肽）治疗的患者（n=74），其牙周炎分期（_χ²= 23.516, P < 0.001）和分级（_χ²= 10.932, P = 0.004）均显著优于未治疗组（n=76）。此外，激动剂使用时间越长，牙周炎改善程度越大（分期：_χ²= 9.456, P = 0.002；分级：_χ²= 6.688, P = 0.01）。

讨论

本研究发现并阐明了GIPR和GLP1R在调控PDLSCs功能中的不同作用：GIPR主要通过激活MAPK/ERK通路促进细胞增殖，而GLP1R则通过抑制IFIT蛋白复合物的形成，解除其对分化相关mRNA翻译的抑制，从而增强多向分化能力。这种功能分化可能源于受体下游信号通路的偏好性激活或细胞类型特异性。研究还揭示了GLP1R/GIPR表达受口腔微环境应激因素（如炎症、高糖）下调，而在轻度缺氧或机械应力下可能上调，提示其表达受复杂调控。动物实验和临床观察均证实，靶向这两个受体能有效促进PDLSCs介导的牙周组织再生。这些发现不仅加深了对牙周炎病理机制的理解，也为开发基于肠促胰岛素受体信号的新型牙周再生治疗策略提供了坚实的理论基础和实验依据。未来研究需进一步阐明GLP1R/GIPR在牙周微环境中的精确调控网络及其与其他干细胞群体的相互作用，以推动其临床转化。