《Epigenetics & Chromatin》：SETDB1/ATF7IP regulate the precise genome engineering of HUSH-regulated genes
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本文揭示了染色质调节因子对精确基因组编辑（PGE）的关键影响。研究者通过全基因组CRISPR筛选，发现组蛋白甲基转移酶复合物SETDB1/ATF7IP及其下游人类沉默中枢（HUSH）复合物是单链DNA整合（ssDI）这一同源定向修复（HDR）子途径的强力负调控因子。这一调控作用特异性地影响转基因报告基因和HUSH调控的单拷贝基因，而非其他内源位点。文章论证了染色质结构（尤其是异染色质）是遗传重组的重要屏障，并通过调节H3K9me3等表观遗传标记，为提高内源位点的PGE效率提供了新的策略思路。
背景
可编程核酸酶的应用彻底改变了基因组编辑和功能基因组学研究。CRISPR/Cas9系统能够方便、精确地在体内引入靶向基因组损伤（通常是DNA双链断裂，DSBs）。在存在同源供体的情况下，这些损伤通过同源定向修复（HDR）途径促进高效率的精确基因组编辑（PGE）。然而，由于DSBs可能导致基因组不稳定，大量研究工作已投入到仅需在染色体DNA一条链上制造缺口（nicking）的方法中，例如碱基编辑器。研究人员已在人类细胞中证明，使用Cas9的切口酶变体与寡脱氧核苷酸（ODN）供体进行的PGE，至少可以通过两个HDR子途径进行：合成依赖链退火（SDSA）和单链DNA整合（ssDI）。具体使用哪条途径，取决于被切割的染色体链（正义链或反义链/Watson链或Crick链）以及供体ODN的链取向。
尽管哺乳动物SDSA的机制已被较为透彻地理解，但ssDI的机制尚不清楚。为了从遗传学角度洞察ssDI，研究者进行了一项全基因组CRISPR敲除筛选，以鉴定那些在缺失时能够增强ssDI的基因。该筛选发现了蛋白赖氨酸甲基转移酶（PKMT）SETDB1:ATF7IP异二聚体及其下游的人类沉默中枢（HUSH）复合物是ssDI的强力负调控因子。与它们已知的生物学效应一致，SETDB1/ATF7IP和HUSH对ssDI的负调控作用对转基因报告基因和一个HUSH调控的单拷贝基因具有特异性，而在其他（非HUSH调控的）单拷贝内源基因座中并未观察到。
这些实验总体上强调了染色质修饰因子——进而延伸至染色质结构——对PGE结果的深远影响。具体来说，研究者确定了当靶标是转基因时，SETDB1/ATF7IP和HUSH复合物是HDR子途径ssDI的主要负调控因子。这些实验证明染色质可以作为遗传重组的有效屏障，并有力地支持了将类似的染色质调节策略扩展到内源单拷贝基因座以提高PGE效率的可行性。
方法
本研究使用了多种细胞系，包括单倍体人类细胞系HAP1和人类结直肠癌细胞系HCT116。研究人员构建了多种报告系统来评估ssDI效率：
- 1.
HAP1全基因组筛选细胞系：通过piggyBac转座子和CRISPR/Cas9介导的基因靶向，在HAP1细胞中构建了一个可诱导表达Cas9并整合了双药物报告基因（Blasticidin和IMPDH，均被双终止密码子失活）的系统。
- 2.
HCT116验证细胞系：在HCT116细胞的HPRT1基因座整合了一个GFP-P2A-失活mCherry报告基因。随后利用CRISPR/Cas9敲除了候选基因（SETDB1、ATF7IP、MPP8、PPHLN1、TASOR、MORC2、EHMT2和SUV39H1），并建立了相应的回复突变细胞系。
- 3.
内源基因报告系统：在HCT116细胞中，通过ssDI在PIGA和CD81基因中引入失活突变，创建了内源基因报告系统。同时，在HCT116细胞的PCDHGB2（一个已知的HUSH调控基因）中引入了失活突变。
全基因组CRISPR敲除筛选：在构建的HAP1报告细胞系中，用Brunello全基因组sgRNA文库进行感染，随后通过诱导Cas9表达进行基因敲除。然后分两轮进行ssDI介导的药物（BSD和MPA）筛选，以富集那些敲除后能增强ssDI效率的基因对应的sgRNA。通过深度测序和生物信息学分析，鉴定出富集的基因。
ssDI效率评估：对于转基因报告基因（如mCherry校正），通过流式细胞术测量校正后表达荧光蛋白的细胞比例。对于内源基因报告系统（如PIGA），使用荧光标记的Aerolysin（FLAER）染色和流式细胞术进行功能筛选。对于PCDHGB2位点的编辑效率，则通过下一代测序（NGS）进行精确定量。
基因表达分析：使用RT-qPCR技术检测SETDB1/ATF7IP缺失对报告基因（BSD/IMPDH）以及内源HUSH调控基因（PCDHGB2）表达水平的影响。
结果
全基因组筛选发现ssDI的负调控因子
为了识别调控ssDI的基因，研究者在单倍体人类细胞系HAP1中进行了全基因组CRISPR/Cas9敲除筛选。筛选策略如图2和图3所示。研究者构建了一个含有可诱导Cas9表达系统和整合在AAVS1安全港位点的双药物报告基因（BSD和IMPDH，均因双终止密码子失活）的HAP1细胞系。感染Brunello sgRNA文库后，通过两轮连续的ssDI介导的药物（BSD和MPA）筛选，富集那些在基因缺失时能增强ssDI的细胞克隆。对最终存活细胞的sgRNA进行测序和分析，发现SETDB1:ATF7IP异二聚体是ssDI最显著的负调控因子之一（图4）。此外，HUSH复合物的部分成员（MPP8和PPHLN1）也在筛选中被弱富集，提示该通路可能参与调控。
SETDB1:ATF7IP及HUSH复合物验证为转基因报告基因ssDI的负调控因子
为了验证筛选结果，研究者在HCT116细胞中构建了独立的GFP-失活mCherry报告系统。通过CRISPR/Cas9分别敲除SETDB1、ATF7IP、HUSH复合物成员（MPP8、PPHLN1、TASOR、MORC2）以及其他H3K9me3甲基转移酶（EHMT2、SUV39H1）。ssDI校正实验表明，SETDB1或ATF7IP敲除细胞的校正效率比野生型细胞高3-5倍（图5A, B）。回复SETDB1或ATF7IP表达能显著降低ssDI效率，证实了表型的特异性。同样，HUSH复合物成员敲除也导致ssDI效率类似程度（约3倍）的提升。而敲除EHMT2或SUV39H1则未影响ssDI效率，表明SETDB1:ATF7IP/HUSH通路对ssDI的调控具有特异性。
SETDB1:ATF7IP调控HUSH调控的内源单拷贝基因的ssDI
已知SETDB1:ATF7IP/HUSH复合物也调控少数内源单拷贝基因（如一些免疫和神经调节基因）。研究者选择了其中之一——原钙粘蛋白γ亚家族B2（PCDHGB2）进行验证。RT-qPCR证实，在HCT116细胞中敲除SETDB1可导致PCDHGB2mRNA表达水平大幅升高（约20倍）。研究者随后在野生型和SETDB1敲除的HCT116细胞背景下，于PCDHGB2基因中引入了相同的失活突变，并进行了ssDI校正。NGS定量分析显示，在SETDB1缺失的细胞中，PCDHGB2位点的ssDI编辑频率显著提高（约2倍）（图6A）。这表明SETDB1:ATF7IP/HUSH通路不仅负调控转基因的ssDI，也负调控其天然靶基因的ssDI。
SETDB1:ATF7IP不调控非HUSH靶标的内源基因ssDI
有趣的是，研究者观察到在SETDB1、ATF7IP或HUSH成员缺失的细胞中，整合的报告基因（GFP或BSD/IMPDH）表达水平显著增强（图7，RT-qPCR证实提升5-6倍）。这提示，对这些转基因和PCDHGB2的ssDI效率提升，可能源于SETDB1/ATF7IP缺失导致的局部染色质状态从抑制性（异染色质）向允许性（常染色质）转变。为了检验这一假设，研究者评估了SETDB1/ATF7IP缺失对两个非HUSH调控的内源基因（PIGA和CD81）ssDI效率的影响。通过功能筛选（FLAER染色或流式细胞术）和NGS定量分析，发现无论是在克隆细胞系还是混合细胞群中，敲除SETDB1或ATF7IP均未显著改变PIGA或CD81位点的ssDI效率（图6B-D）。这表明SETDB1:ATF7IP/HUSH通路对ssDI的负调控作用具有位点特异性，主要针对其天然调控的转基因或内源基因座。
结论
本研究通过全基因组筛选，首次将组蛋白甲基转移酶复合物SETDB1:ATF7IP及其下游效应复合物HUSH鉴定为HDR子途径ssDI的关键负调控因子。这种调控具有显著的靶点特异性：SETDB1/ATF7IP的缺失能显著提升其在转基因报告基因和HUSH调控的内源单拷贝基因（如PCDHGB2）上的ssDI效率，但对于非其调控靶标的内源基因（如PIGA和CD81）则无影响。机制上，这种效应很可能与SETDB1/ATF7IP催化产生的H3K9三甲基化（H3K9me3）修饰有关，该修饰招募HUSH复合物形成抑制性染色质环境，从而阻碍了基于ODN供体的ssDI修复途径。
这项研究具有重要意义：它从概念上证明了局部染色质环境是精确基因组编辑，特别是ssDI途径的关键决定因素。研究结果提示，通过干预特定的染色质修饰因子（如抑制SETDB1/ATF7IP或HUSH复合物的功能），可以作为一种调节策略，有选择性地提升在难编辑的异染色质区域或特定表观遗传调控位点进行PGE的效率，为下一代基因治疗和功能基因组学研究提供了新的思路。
