芝麻菜源纳米囊泡——可持续食品纳米成分的制备、稳定性及其口服生物利用度研究

《Food Production, Processing and Nutrition》：Arugula leaf nanovesicles as sustainable food ingredient: processing, stability, and bioavailability

【期刊编辑推荐语】本研究开发了一种从芝麻菜叶中规模化制备植物源纳米囊泡（ALVs）的创新工艺（结合超滤/尺寸排阻层析与喷雾干燥），并系统表征了其结构、生化成分（含氨基酸、脂肪酸、酚酸、黄酮、木脂素及植物miRNA）与长期稳定性。重要的是，实验证明ALVs可安全穿越分化的Caco-2肠道单层屏障而不影响其完整性（TEER未受损），提示其具有良好的口服生物利用度，为将其作为可持续、稳定且具生物活性的纳米载体应用于功能性食品与保健品领域奠定了坚实基础。

　　

引言

对天然存在于食物中的胶体结构的探索为食品科学的基础与应用研究开辟了新视角。其中，植物源纳米囊泡（PDVs）作为源自可食用资源的自组装纳米结构近年来受到关注。PDVs是直径为30–150 nm的圆形结构，天然含有多种在细胞间通讯中起关键作用的生物活性化合物，包括脂质、蛋白质、遗传物质（DNA、miRNA）和代谢物。PDVs可通过适当的植物材料组织加工人工获得，其内容物反映了植物基质的植物化学特征，是生物活性化合物的天然生物载体。这些囊泡具有双层组织、生物活性分子封装以及与生物界面相互作用的能力，其固有的纳米级结构使其成为增强天然食品成分稳定性和功能递送的有希望的候选者。然而，它们在食品和保健品系统中的应用需要解决胶体递送载体面临的常见挑战：生产的可扩展性、储存期间完整性的保持以及口服后生物利用度的可重现性。

在本研究中，芝麻菜（Eruca sativa）叶被用作一个有价值的研究模型。它们富含酚类、黄酮类、芥子油苷衍生的代谢物，并作为人类饮食的一部分被广泛食用。从芝麻菜中分离纳米囊泡不仅提供了纳米级载体的可持续来源，也提供了一个与保健品开发兼容的食品级体系。通过应用超滤-尺寸排阻纯化和喷雾干燥稳定等可规模化工艺，可以在保持其生化有效载荷和功能完整性的同时生产出稳定的纳米结构。

材料与方法

研究采用市售即食芝麻菜叶。植物源纳米囊泡的获取、纯化和稳定化方法包括：将蔬菜基质匀浆以获取匀浆物；通过筛分从匀浆物中分离出汁液；使用两种截留分子量（100 kDa和10 kDa）的超滤（UF）结合尺寸排阻色谱（SEC，使用Izon qEV Original 35 nm层析柱）对获得的纳米囊泡进行分离和纯化，收集特定洗脱组分；通过喷雾干燥对纳米囊泡进行稳定化。

样品表征采用了多种技术：动态光散射（DLS）用于评估Z-平均粒径（D_h）和多分散指数（PDI）；纳米颗粒跟踪分析（NTA）用于分析粒径分布和浓度。喷雾干燥过程参数经过优化（入口温度120°C，进料流速5.0 mL/min等）。采用冷冻电子显微镜（Cryo-EM）对喷雾干燥后复溶的样品进行形态学分析。拉曼光谱使用1064 nm激光源进行分析。通过圆二色谱（CD）分析蛋白质二级结构，并利用本征荧光光谱探究蛋白质三级结构环境。

对于ALVs化学成分的分析，采用高分辨液相色谱-串联质谱（LC-HRMS）鉴定次级代谢物，并通过miRNA测序分析其miRNA含量。为评估ALVs在肠道模型中的行为，研究使用分化的人肠道Caco-2细胞。通过MTT法评估ALVs的潜在细胞毒性。通过使用Merocyanine 540染料标记ALVs，并在Transwell系统中培养分化的Caco-2细胞单层，评估其跨上皮转运能力。在转运实验前后，通过测量跨上皮电阻（TEER）评估细胞单层完整性。通过共聚焦显微镜观察标记ALVs在细胞内的定位。

结果

ALVs的生产与化学表征

ALVs的生产与稳定化

本研究开发了一种高效的方法来获取PDVs，同时保持其结构和形态。应用尺寸排阻色谱（SEC）结合超滤（UF）来生产纯化的样品。与超速离心（UC）纯化的样品相比，采用UF/SEC纯化的样品在DLS和NTA分析中显示出更小的粒径和更窄的分布。UC纯化的ALVs在DLS上表现出高度多分散性（PDI > 0.5），并且NTA检测到聚集体的存在。UF/SEC纯化略微降低了颗粒浓度，但产生了粒径更小、PDI更窄的囊泡。因此，选择UF/SEC而非UC来纯化ALVs，并评估喷雾干燥对囊泡稳定性的影响。结果表明，喷雾干燥过程并未影响ALVs的粒径分布或浓度，复溶干燥粉末的D_h与喷雾干燥前相当（D_h,f/D_h,i= 0.9），且DLS和NTA均未检测到聚集体。这些结果强调了纯化方法对ALVs粒径分布和浓度的影响。补充数据表明，ALVs在长达24个月的储存中保持了囊泡浓度的稳定性。

基于这些发现，获得富含且稳定ALV组分的最佳方案是结合UF/SEC纯化与喷雾干燥。Cryo-EM分析揭示了两种结构：一种是具有类似膜的清晰边缘、完全填充的0.5–2 μm结构；另一种是可能对应脂质滴的50–200 nm、没有清晰边缘的结构。

ALVs的物理化学表征

通过生化和光谱技术对采用UF/SEC结合喷雾干燥获得的ALVs进行了物理化学表征。Bradford法测定ALVs的蛋白质含量为6.25 (± 0.38) μg/mL。圆二色谱（CD）在远紫外区（190–250 nm）的光谱显示在193 nm处有一个正的Cotton效应，在208和222 nm处有两个负的Cotton效应，表明存在α-螺旋蛋白质，可能位于囊泡膜层内。本征荧光光谱分析显示，在280 nm激发下，ALVs的最大荧光发射（λmax）在330–332 nm，表明色氨酸（Trp）残基被埋藏在蛋白质内部，这与CD结果一致，提示α-螺旋主要位于囊泡膜中。

拉曼光谱进一步分析了ALVs的生化指纹。ALVs的平均光谱显示出核酸（720–828 cm^-1）、苯丙氨酸（1002 cm^-1）以及脂质/蛋白质标记物（1450 cm^-1处的CH和CH₂基团）的特征峰。还检测到883 cm^-1（蛋白质）、1084 cm^-1（核酸中的磷酸二酯基团）和1337 cm^-1（蛋白质和DNA）等额外峰。这些发现为了解ALVs的分子组成提供了宝贵信息，并为后续的代谢组学和转录组学分析奠定了基础。

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ALVs来源的生物活性成分鉴定

采用代谢组学方法和miRNA测序分别对ALVs的化学成分进行了表征。通过超声破坏ALVs，然后离心分离脂质外结构与内部囊泡内容物。使用液相色谱高分辨质谱（LC-HRMS）分析所得内容物组成。共鉴定出26种代谢物，包括氨基酸（如L-亮氨酸+L-异亮氨酸、L-精氨酸、L-色氨酸、L-苯丙氨酸）、脂肪酸（如亚油酸、肉豆蔻酸、棕榈油酸）、羧酸（如琥珀酸、L-苹果酸、富马酸、4-羟基苯甲醛、水杨酸、肉桂酸、对香豆酸、异丁香酚、没食子酸、柠檬酸、阿魏酸）、酚类化合物（如红景天苷）以及黄酮类（如芹菜素、紫云英苷、槲皮素-3-O-葡萄糖苷）。此外，还鉴定出呋喃木脂素，包括松脂醇二葡萄糖苷及其甲酸加合物。

为了分析ALVs的miRNA含量，从100 mg ALV粉末中提取总RNA并进行miRNA测序。测序结果与所有已知成熟miRNA序列比对，以鉴定潜在的miRNA。在检测到的miRNA中，包括mir165、miR166、miR167等家族成员。

利用分化的人肠道Caco-2细胞进行ALVs体外生物利用度研究

在进行跨上皮转运实验之前，通过MTT法评估了ALVs对Caco-2细胞的潜在细胞毒性作用。结果表明，在0.05–1 mg/mL（对应3.35 × 10⁶至 67 × 10⁶ALVs/mL）的浓度范围内，ALVs对人肠道Caco-2细胞无毒性。

为了评估ALV穿过肠道屏障的能力，用MC540标记ALVs（ALVs-MC540），并在基底侧（BL）溶液中测量荧光。将浓度为0.5 mg/mL的ALVs-MC540在顶侧（AP）室中孵育2小时和4小时后，在BL室中检测到580 nm（激发530 nm）的荧光信号。以相对荧光单位（RFU）表示的结果表明，ALVs-MC540的转运具有时间依赖性，2小时后RFU值为222,981.00 ± 32%，4小时后为673,671.00 ± 25%。定量分析显示，孵育4小时后，有26.6%的ALVs-MC540出现在BL溶液中。

在实验过程中，通过测量跨上皮电阻（TEER）来监测Caco-2单层的完整性。TEER测量结果证实，在AP侧孵育ALVs-MC540不会影响单层通透性，表明样品在长达4小时的暴露中是安全的。与此结果一致，共聚焦显微镜形态学分析进一步支持了这些发现，在处理2小时后，在Caco-2细胞的细胞质中观察到了细胞内红色荧光信号。值得注意的是，在8 × 10⁶ALVs/mL浓度下，细胞内荧光比在40 × 10⁶ALVs/mL浓度下更为明显，表明囊泡的摄取具有浓度依赖性。

讨论

ALVs的生产、稳定化与化学表征

本研究引入了一种创新的、采用集成操作流程的自下而上方法，用于分离植物纳米囊泡和植物脂质纳米颗粒复合物。传统上，获取植物源囊泡最广泛使用的方法是基于差速超速离心（UC）。然而，UC方法的主要局限在于其耗时，且产生的组分由不纯、聚集且结构完整性受损的PDVs组成。

为了克服这些限制，研究开发了一种利用UF结合SEC的定制方案。结果表明，该方法能高效地从新鲜芝麻菜叶匀浆中生成、分离和纯化植物囊泡和脂质纳米颗粒。与UC相比，UF-SEC是一种更具特异性、通用性且可工业规模化的方法，适用于多种食品基质。比较分析表明，尽管UC可以富集ALV组分，但其纯化程度显著低于UF-SEC，导致样品高度异质且聚集。此外，UC过程中施加的高离心力可能损害ALVs的结构完整性。

通过DLS、NTA和Cryo-EM表征表明，通过这项创新技术获得的ALVs结构完整、纯度高且数量充足。Cryo-EM分析揭示了两类不同的囊泡群体：少数为外泌体样结构（0.5–2 μm），多数为50–200 nm的脂质滴（LDs）。这些较小的脂质颗粒，其尺寸超出了典型的内源性植物LDs范围，可能在加工过程中自发形成。有研究表明，纳米级LDs能够有效穿越细胞屏障，并提供抗氧化保护和作为自纳米乳化药物递送系统。

为了使ALVs在实际应用（如食品补充剂和/或功能性食品的配方）中稳定，采用了喷雾干燥工艺，使其能够长期储存，同时保持囊泡的尺寸、浓度和结构完整性。与可能导致囊泡膜损伤和内容物泄漏的冷冻不同，喷雾干燥具有可重复、经济、快速且易于规模化的优点。该工艺得到的最终产品每毫升含有6700万至7800万个非聚集纳米囊泡，电位中性，直径在50 nm至2 μm之间。

使用CD、本征荧光和拉曼光谱进行的生化分析证实了α-螺旋蛋白质的存在，并提供了ALVs的详细指纹。代谢组学分析鉴定出26种次级代谢物，包括氨基酸、脂肪酸、多酚、羧酸和嘌呤碱基。这些化合物与芝麻菜叶的植物化学特征一致，已知具有抗氧化、抗炎、抗癌、神经保护、抗菌和降胆固醇等活性。此外，miRNA测序在1736个序列中发现了181个已知的植物miRNA，其中一些高度富集（如mir165、miR166、miR167）。尽管哺乳动物miRNA的功能已被广泛研究，但植物来源的miRNA在哺乳动物生物体中的跨界调控研究仍处于起步阶段。有报道称，通过饮食口服摄入后，包裹在纳米囊泡中的植物miRNA可以在消化道中存活，进入循环系统，并调控内源性mRNA。未来的研究将侧重于通过应用靶标预测和验证方法，评估富集在ALVs中的miRNA可能对哺乳动物基因组产生的潜在影响。

ALVs体外跨上皮转运

文献数据表明，源自不同植物物种（如果汁、根、叶和种子）的囊泡显示出不同的治疗潜力，这由其生物活性化合物内容物介导。基于其化学成分，可以合理地假设ALVs具有内在的生物活性。然而，由于生物利用度是研究食物来源生物活性化合物的关键步骤，它们必须能够穿过肠道屏障。

为了评估ALVs在肠道水平被吸收的能力，研究采用了分化的人Caco-2细胞，并专门开发了用于ALVs荧光标记的方案。结果强调，ALVs可以成功地被肠道细胞转运，比较BL和AP室的荧光百分比可以发现，ALVs的吸收具有时间依赖性，4小时后顶室中26.6%的囊泡进入基底室。共聚焦显微镜分析证实，荧光标记的ALVs被肠上皮细胞以剂量依赖的方式吸收，并成功定位于细胞内。在实验过程中测量的TEER结果表明，ALVs不会对这些值产生负面影响，这表明它们对细胞单层的完整性和通透性是安全的。需要进一步的实验来阐明ALVs进入和穿过肠道细胞的作用机制，但研究假设可能发生转胞吞作用和/或吞噬作用。ALVs在0.05–1 mg/mL（3.35 × 10⁶ALVs/mL – 67 × 10⁶ALVs/mL）的浓度范围内不会改变处理的人肠道Caco-2细胞的活力。这些结果与最近的数据一致，表明柠檬来源的囊泡富含柠檬酸和维生素C，并对间充质干细胞显示出显著的抗氧化应激保护作用；在草莓来源的囊泡处理的间充质干细胞中也观察到了剂量依赖性的氧化应激预防作用。文献证据初步表明，植物纳米囊泡在细胞和动物模型中发挥抗氧化活性，但其作用机制研究尚不充分。本研究获得的结果成功解决了关于ALVs能够被肠道细胞随时间并以剂量依赖性方式转运，且不影响肠道通透性和完整性的首要问题。

结论

本研究介绍了一种用于生产植物食品纳米囊泡的通用且环境友好的工作流程。由于其独特的形态、结构和功能特性，植物源纳米囊泡代表了一种潜在的食品成分，可用于食品和保健品领域的进一步应用。毫无疑问，这项研究是开辟这一创新研究领域的第一步，但还需要进一步的研究，通过基于细胞的实验来研究PDVs的生物学特性，以获得关于PDVs的生物活性内容物能否到达细胞靶点并发挥其生物活性的证据。此外，体内研究对于建立PDVs生物利用度的概念验证以及确认其潜在的健康促进作用至关重要。