《Food Production, Processing and Nutrition》：Insoluble-bound phenolics of selected Andean common bean flours as affected by cooking: characterization and antioxidant activity
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本研究首次系统表征了三种安第斯普通豆（Peumo、Magnum、Mantequilla）品种在生豆与熟豆状态下不溶性结合酚类（IBPs）的组成、总酚含量（TPC）及其抗氧化活性（AA），揭示了不同品种间的显著差异以及烹调对酚类物质和抗氧化活性的复杂影响，其中Peumo品种表现出最高的TPC和AA。该研究填补了相关豆类品种在IBPs研究方面的知识空白，并为理解烹饪加工对豆类生物活性成分的影响提供了重要数据。
引言背景与重要性
普通菜豆（Phaseolus vulgaris L.）是全球消费最广泛的豆类之一。多项研究表明，食用普通菜豆与降低多种非传染性疾病风险相关，如特定癌症、心血管疾病、2型糖尿病和肥胖等。这种健康益处部分归因于其酚类化合物（PCs）含量。酚类化合物存在于食物的可溶形式（如游离、酯化、醚化）和与细胞壁通过物理化学作用结合的不溶性结合形式（IBPs）中。有研究指出，在某些豆类中，超过95%的总酚含量可能存在于不溶性结合部分。酚类化合物的抗氧化活性（AA）主要源于其通过氢原子或电子转移中和自由基的能力，并在预防与氧化应激相关的疾病中发挥重要作用。此外，摄入不溶性结合酚类被认为是一种重要的策略，可以改善肠道微生物群环境，并可能在摄入后数天（最多4天）在人体血浆中检测到由其肠道微生物发酵产生的低分子量酚类物质，表明其益处可能超越局部肠道效应，具有预防全身性氧化应激和/或炎症的潜力。先前研究仅关注了安第斯豆类品种可溶性酚类部分的化学特征和潜在生物活性，因此，本研究旨在首次表征来自三种安第斯豆类品种（Peumo、Magnum、Mantequilla）的生豆和熟豆制备的、富含不溶性结合酚类的豆粉的酚类谱和抗氧化活性。
材料与方法
研究所用的三种豆类种子（Peumo、Magnum 和 Mantequilla）来自智利中部的马乌莱地区。豆子经过浸泡和煮沸（60分钟）烹饪处理。研究聚焦于提取可溶性酚类后剩余的豆粉（富含不溶性结合化合物）。不溶性结合酚类（IBPs）通过碱水解（2 M NaOH）并在氮气氛围下搅拌4小时进行提取，随后酸化和乙酸乙酯萃取。总酚含量（TPC）采用Folin-Ciocalteu法测定，结果以每克干样品中没食子酸当量毫克数（mg GAE/g dry sample）表示。抗氧化活性（AA）通过四种方法评估：ORAC（氧自由基吸收能力）、FRAP（铁离子还原/抗氧化能力）、DPPH（1,1-二苯基-2-三硝基苯肼自由基清除）和ABTS（2,2'-联氮-双-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸自由基阳离子清除）法，结果均以每克干样品中Trolox当量微摩尔数（μmol TE/g dry sample）表示。酚类化合物的鉴定和定量通过超高效液相色谱-电喷雾串联质谱（UPLC-ESI-MS/MS）结合多重反应监测（MRM）模式和标准品进行。数据使用STATA 15.0软件进行统计分析。
酚类鉴定与定量
本研究首次全面报告了三种安第斯普通豆粉品种（Peumo、Magnum、Mantequilla）中的不溶性结合酚类。通过碱水解提取物检测并测量了酚类化合物。在生Peumo样品中鉴定出7种酚酸和10种类黄酮，而熟Peumo样品含有8种酚酸和10种类黄酮。对于Magnum品种，生和熟样品均显示出8种酚酸和11种类黄酮的存在。最后，在Mantequilla品种中，生样品鉴定出8种酚酸和8种类黄酮，而熟样品检测到8种酚酸和7种类黄酮。
具体而言，在Peumo品种中，主要的酚酸是3,4-二羟基苯甲酸，生熟样品含量分别为8.38和4.78 μg/g干重；最主要的类黄酮是儿茶素（Catechin），生熟样品含量分别为9.69和8.25 μg/g。对于Magnum品种，阿魏酸是最丰富的酚酸，生熟样品含量分别为4.76和5.02 μg/g；儿茶素同样是主要的类黄酮，生熟样品含量分别为8.29和7.86 μg/g。在Mantequilla品种中，与Magnum类似，阿魏酸是最普遍的酚酸，生熟样品含量分别为4.62和5.16 μg/g；最主要的类黄酮是紫杉叶素（Taxifolin），生熟样品含量分别为0.16和0.3 μg/g。
烹调对不溶性结合酚类的影响
烹调并未在所有研究的品种中一致地减少已鉴定的酚类化合物。在Peumo品种中，烹调显著降低了六种酚类化合物（3,4-二羟基苯甲酸、香草酸、儿茶素、山奈酚、表儿茶素、杨梅素）的浓度，其中杨梅素的损失最为显著。相比之下，烹调导致Peumo品种中另外六种酚类化合物（没食子酸、阿魏酸、芥子酸、咖啡酸、槲皮素、紫杉叶素）的浓度增加，其中最显著的是槲皮素，增加了120%以上。
在Magnum品种中，烹调显著降低了七种酚类化合物（没食子酸、对香豆酸、3,4-二羟基苯甲酸、香草酸、槲皮素、杨梅素、槲皮苷），其中没食子酸减少了超过60%。然而，咖啡酸和紫杉叶素的含量有所增加，而另外六种酚类化合物（丁香酸、芥子酸、阿魏酸、儿茶素、山奈酚和表儿茶素）在生熟样品间未显示显著变化。
对于Mantequilla品种，烹调导致七种酚类化合物（没食子酸、丁香酸、芥子酸、槲皮素、山奈酚、杨梅素、槲皮苷）的浓度显著降低，其中芥子酸下降最显著（烹调后仅检测到痕量）。相反，紫杉叶素增加了87%，而对香豆酸未受影响。这些发现表明，烹调对每个品种的酚类化合物影响不同，并未导致这些酚类化合物普遍减少或增加的一致趋势。
值得注意的是，在所有品种中，类黄酮紫杉叶素的含量在烹调后均持续增加。同样，阿魏酸在Peumo和Mantequilla品种中烹调后浓度增加，在Magnum品种中观察到非显著性上升。最后，丁香酸在Peumo和Magnum中保持不变，对香豆酸在Magnum和Mantequilla豆粉中未观察到烹调效应。
总酚含量（TPC）
总酚含量（TPC）值表明，无论是生样还是熟样，Mantequilla品种的酚类含量最低，生熟豆粉的值分别为0.17和0.14 mg GAE/g干重，没有显著差异。相比之下，Magnum品种的生熟样品TPC值分别为2.38和1.98 mg GAE/g干重，无统计学显著差异。然而，Peumo品种的生熟样品TPC最高，值分别为3.82和2.32 mg GAE/g干重，烹调后显示出统计学上的显著降低。
抗氧化活性评估
对三种豆粉品种生熟状态的四种测定（ABTS、DPPH、FRAP、ORAC）抗氧化活性（AA）结果表明，总体而言，Peumo和Magnum品种的生样品比熟样品表现出更高的抗氧化活性。Peumo对烹调最敏感，各测定方法的平均抗氧化活性降低了28%，而Magnum显示出较小的12%的降低。相反，在四种测定方法中的三种，烹调使Mantequilla品种的抗氧化活性增加了约50%。这种烹调对抗氧化活性的差异性影响与通过UPLC-ESI-MS/MS测量的酚类含量观察到的变化一致。
与总酚含量结果一致，Peumo豆粉品种显示出最强的抗氧化活性，在ABTS测定中，生熟样品的值分别高达27.93和19.36 μmol TE/g干重，在FRAP测定中分别为27.16和22.03 μmol TE/g干重。Magnum品种的抗氧化活性值范围，在DPPH测定中，生熟样品分别为4.94和4.01 μmol TE/g干重，在FRAP测定中分别为22.87和21.05 μmol TE/g干重。
Mantequilla品种表现出最低的抗氧化活性。然而，它显示出一种不寻常的模式，即熟样品的抗氧化活性高于生样品，这一点在ORAC测定中得到证实，其中生豆粉样品的测量值为0.81 μmol TE/g干重，而熟豆粉的对应值为1.16 μmol TE/g干重。
最后，评估了总酚含量与每种测定方法的抗氧化活性之间的相关性。所有分析的组合均观察到强正相关，表明不溶性结合酚类对样品的抗氧化能力有显著贡献。具体而言，ABTS/TPC（r = 0.99, p < 0.001）和DPPH/TPC（r = 0.99, p < 0.001）显示出几乎完美的相关性，而DPPH/TPC（r = 0.96, p = 0.002）和ORAC/TPC（r = 0.97, p = 0.002）测定也显示出很强的相关性，且均具有统计学显著性。这些结果表明，总酚含量是研究样品抗氧化活性的主要决定因素。
酚类表征的讨论
酚类化合物在植物代谢中扮演多种角色。鉴于酚类化合物以可溶性和不溶性结合形式存在，值得注意的是后者研究较少，尽管在某些植物食品基质中，它可能占总酚量的95%。本研究揭示了三种安第斯普通豆粉品种中不溶性结合酚类谱的多样酚酸和类黄酮组成。研究涉及的主要酚类化合物具有多种生物活性。例如，原儿茶酸（PCA）以其抗氧化、抗炎和心脏保护作用而闻名。儿茶素（Catechin）已被证明具有直接和间接的抗氧化作用。阿魏酸（Ferulic acid）被广泛认可其抗氧化活性以及通过细胞因子调节和抑制核因子κB（NF-κB）信号通路的抗炎作用。这些化合物的生物利用度取决于从食物基质中的释放、胃肠道消化、肠道吸收、肝脏中的结合（葡糖醛酸化、硫酸化、甲基化）以及肠道微生物群对未吸收化合物的发酵，将其转化为活性代谢物。这些肠道和肝脏代谢产物强化了这样的观点：即它们的代谢在其生物效应中起着至关重要的作用。
烹调对酚类谱影响的讨论
烹调过程对不同豆粉品种的酚类谱产生了差异化影响：对一些酚类化合物，烹调增加了其水平；对另一些则降低了水平；对其他一些则没有影响。观察到的变化可归因于热降解以及酚类化合物从豆类基质中结合形式的释放。当这种食物基质经受高温时，酚酸与多糖-蛋白质网络之间的共价酯键和醚键可能断裂，增加了如阿魏酸、芥子酸和对香豆酸等化合物的可提取性，这些化合物在烹调后往往保持稳定甚至增加。相比之下，其他酚酸，如3,4-二羟基苯甲酸和香草酸倾向于减少，这可能通过温度和氧气暴露促进的脱羧和氧化反应来解释。另一方面，关于类黄酮，如儿茶素和表儿茶素等黄烷-3-醇对热特别敏感，易于发生差向异构化、聚合和氧化降解，而槲皮素或紫杉叶素等黄酮醇可能由于糖苷键的水解释放出苷元形式而增加。酚类化合物与大量营养素（尤其是酚类化合物-蛋白质和酚类化合物-淀粉比率）之间的瞬时相互作用可以提供保护性或催化性的微环境，调节降解动力学和表观稳定性。一个特别的例子是紫杉叶素（Taxifolin），该研究显示其浓度在烹调后增加。该黄酮类化合物已被证明具有多种生物活性特性，包括抗氧化、抗炎和神经保护作用，并在动物模型和人类研究中显示出对体重管理和非酒精性脂肪性肝炎的潜在益处。
总酚含量与抗氧化活性的讨论
Folin-Ciocalteu测定显示，Peumo和Magnum豆粉品种具有较高的总酚含量。这些豆子分别呈现红色和棕色的种皮。这些总酚含量值可与先前报道的深色豆类水平相媲美。相比之下，具有浅黄色种皮的Mantequilla豆粉品种呈现出与浅色种子相似的总酚含量值。值得注意的是，消费者对深色豆类的偏好可能因其较长的烹饪时间和较硬的质地而受到限制，从而影响其商业可行性，尽管它们具有健康益处。种皮颜色与酚类含量之间的关联表明，干豆种皮中的色素可能影响这些有色种子的总酚含量。
热烹调通常降低了总酚含量，从而降低了抗氧化活性，其中Peumo豆粉品种降低了39%。然而，对于Magnum和Mantequilla豆粉品种，生熟样品之间没有显著差异。这些结果部分可以解释为， hydrothermal treatment（水热处理）削弱了细胞壁基质，由于过程中提供的热能，导致不溶性结合酚类与植物细胞壁结构之间的共价键解离，将这些酚类化合物释放到可溶部分中。然而，煮沸也可能减少绝对酚类含量。
FRAP测定评估了抗氧化剂将三价铁还原为二价铁离子的能力，结果显示抗氧化活性最高，生Peumo豆粉高达27.16 mmol TE/g干重，生Magnum豆粉高达23.40 mmol TE/g干重。关于测量氢原子或电子给予能力的测定，本研究使用了ABTS自由基阳离子和DPPH自由基中和测定。生样品通常表现出比熟样品更大的抗氧化活性。DPPH测定显示，烹调后所有品种的抗氧化活性均下降，Magnum、Peumo和Mantequilla品种分别下降了19%、23%和31%。
ORAC测定测量了具有生物学相关性的过氧自由基和其他活性氧的中和，对于其对氧化应激的影响具有重要意义。在本研究中，烹调使Peumo和Magnum的抗氧化活性分别降低了38%和11%，而在Mantequilla中，它增加了45%。不溶性结合酚类可能对肠道微生物群发挥重要作用，因为它们可以在肠腔中释放，在那里可能被结肠细胞吸收或被结肠细菌代谢。这些物质在血浆中的检测，连同它们的抗氧化和抗炎特性，在摄入后可持续3至4天。这些酚类在结肠中的潜在生物利用度取决于食物基质特性、酚类与食物的相互作用以及存在的酚类的化学性质。
结论
本研究首次详细表征了三种安第斯豆粉品种（Peumo、Magnum和Mantequilla）的不溶性结合酚类谱，揭示了酚酸和类黄酮的多样性含量。研究结果突出了品种间酚类谱和抗氧化活性的显著差异，其中Peumo豆粉品种显示出最高的总酚含量和抗氧化活性。烹调对不同品种的总酚含量和酚类化合物的影响不同，突显了这种食物基质与加工之间的复杂相互作用。然而，热处理总体上降低了所测试材料的抗氧化活性。
