《Biomarker Research》：In vivo engineering of CAR-T cells: delivery strategies and clinical translation
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这篇综述系统阐述了活体（in vivo）CAR-T细胞工程作为新一代细胞免疫疗法的前沿进展。文章重点梳理了病毒（如慢病毒、腺相关病毒）和非病毒（如脂质纳米粒）递送平台的技术原理、各自优劣与临床转化挑战，探讨了CAR分子结构的适配性优化。中心思想在于，这种策略通过系统性递送CAR编码构建体，直接在体内重编程内源性T细胞，有望规避传统体外（ex vivo）制备的复杂流程和高昂成本，推动CAR-T疗法向更简化、可扩展且“即用型”（off-the-shelf）方向发展，从而拓展其在肿瘤及自身免疫病等领域的应用前景。
背景
嵌合抗原受体（CAR）-T细胞疗法已彻底改变了血液恶性肿瘤的治疗格局。然而，其广泛的临床应用受到与体外细胞制造相关的物流、经济和安全负担的限制。活体CAR-T工程作为一种变革性替代方案应运而生，它通过病毒或非病毒载体系统递送CAR编码构建体，实现对内源性T细胞的直接重编程。该策略无需白细胞分离、体外基因修饰和回输，为简化、可扩展且潜在的“即用型”免疫疗法铺平了道路。尽管细胞因子释放综合征（CRS）和免疫效应细胞相关神经毒性综合征（ICANS）等挑战仍然是其与体外疗法共有的障碍，但活体方法引入了额外的复杂性，包括载体免疫原性和先天性免疫识别。通过利用基于RNA的平台，活体CAR-T工程正演变为一种超越肿瘤学的可编程免疫治疗模式。
活体CAR-T细胞工程的原理
活体工程T细胞的能力代表了过继性细胞疗法的范式转变。与传统方法需要分离T细胞、外源性基因转移以及在受控生物反应器环境中大量扩增不同，活体CAR-T细胞工程在体内对淋巴细胞进行原位重编程，将患者自身转变为一个自包含的、自体生物反应器。这种方法消除了对集中制造设施的需求，缩短了从诊断到治疗的时间，并可能拓宽在基础设施或供者可用性有限地区的治疗可及性。此外，通过绕过体外扩增的选择压力，活体策略可以减少产品表型、功能和效力方面的患者间差异。
活体CAR-T细胞生成的递送策略
活体CAR-T疗法的发展取决于递送载体的选择，其决定了持久性、安全性和可制造性等关键参数。主要平台分为病毒和非病毒两大类。
病毒载体平台
病毒载体构成了最成熟且经过临床验证的活体CAR-T细胞工程模式，提供了强大的基因转移能力和高转导效率。
慢病毒载体源自人类免疫缺陷病毒1型（HIV-1），能够稳定整合到宿主基因组中，实现持久的转基因表达，这一特性使其成为体外CAR-T生产的支柱。其临床转化到活体应用已随着靶向递送系统和安全性优化构建体的开发而获得进展。然而，慢病毒载体由于其整合性质，仍存在插入突变的风险。
γ-逆转录病毒载体是最早用于CAR-T开发的载体之一。与慢病毒一样，它们通过逆转录和病毒整合酶将互补DNA插入宿主基因组来实现稳定的基因整合。然而，γ-逆转录病毒在核进入过程中严格依赖细胞分裂，这使得它们不适合靶向体内静息的T细胞。尽管在早期体外CAR-T制造中具有重要作用，但由于安全性担忧，其临床应用已显著受限。
腺相关病毒（AAV）载体为活体CAR-T递送提供了一个非整合平台，具有出色的安全性记录。与整合载体不同，AAV在转导后主要以附加体形式存在，从而最大限度地降低了插入突变的风险。AAV能够高效转导分裂和非分裂细胞，并可通过衣壳工程和血清型优化来定制以靶向特定的免疫亚群。然而，几个挑战阻碍了其广泛的临床转化。最主要的是对AAV衣壳的预先存在的免疫力，这在人群中普遍存在，可能损害转导功效。此外，AAV有限的包装容量限制了大型或多组件CAR构建体的整合。
非病毒平台
非病毒递送系统正迅速崛起，成为活体CAR-T工程的一个引人注目的替代方案，解决了病毒方法固有的几个局限性，即免疫原性、整合风险、有限的有效载荷容量和制造复杂性。
脂质纳米粒（LNPs）已崛起为一种通用且可扩展的基因递送平台。LNPs由四种主要成分组成：促进核酸封装和内体逃逸的可电离脂质；有助于囊泡结构的磷脂；用于膜稳定性的胆固醇；以及通过减少调理作用和清除来延长循环时间的聚乙二醇（PEG）-脂质缀合物。这些成分自组装成纳米级囊泡，保护遗传物质免于酶降解并促进有效的细胞摄取。
临床前研究表明，封装CAR编码mRNA的T细胞靶向LNPs可以成功地在体内重编程循环T淋巴细胞，在小鼠模型中诱导强大的抗肿瘤反应。然而，一些挑战仍然存在。与病毒载体相比，LNPs通常表现出较低的转染效率，且mRNA表达的瞬时性需要重复给药以维持治疗水平。目前仍缺乏针对RNA疗法的精确靶向LNP系统，这引起了关于脱靶递送到肝细胞和其他非免疫组织的持续担忧。
聚合物纳米粒提供了一个高度可定制的非病毒基因递送平台，具有可调节的物理化学特性和广泛的治疗适应性。例如，聚乳酸-羟基乙酸共聚物（PLGA）通过静电和疏水相互作用诱导纳米颗粒与囊泡膜之间的相互作用，从而导致局部和瞬时的膜流动化和透化。表面修饰策略进一步增强了功能性：阳离子聚合物如聚乙烯亚胺（PEI）可调节PLGA纳米颗粒的表面电位，改善内体逃逸和细胞内化。
与脂质纳米粒相比，聚合物载体展现出更大的设计灵活性、对复杂配方的优异封装效率以及增强的结构稳定性。然而，聚合物纳米颗粒面临几个递送和转化障碍。细胞外和细胞内屏障会限制其生物利用度和细胞内基因转移效率。聚乙二醇化虽然常用于延长循环时间，但可能会损害细胞摄取并引发敏感个体的抗PEG免疫反应。
细胞外囊泡（EVs）包括外泌体和微囊泡，是能够递送多种生物活性物质的天然分泌的纳米载体。由于其内源性脂质双分子层结构，EVs表现出固有的生物相容性、良好的药代动力学和细胞类型特异性趋向性。
在CAR-T细胞工程的背景下，EVs提供了独特的转化优势，包括低免疫原性、递送功能性CAR构建体或调节性有效载荷的能力以及降低的系统毒性风险。然而，关键的障碍阻碍了基于EV的递送系统的临床转化。传统的分离方法产生的囊泡群体具有异质性，并且存在可扩展性差和批次间重现性差的问题。此外，EVs表现出较短的全身半衰期和有限的有效载荷装载效率。
适应活体应用的CAR结构设计
CAR-T疗法的治疗效果不仅受递送平台的影响，而且在很大程度上受嵌合抗原受体分子结构配置的影响。优化CAR设计超越了体外工程原理的改进，是克服与体内基因递送和细胞重编程相关的独特挑战的基础先决条件。
典型的CAR构建体包含一个细胞外抗原结合域（通常是单链可变片段scFv）、一个铰链区、一个跨膜域以及一个或多个细胞内信号基序。根据其胞质设计，CAR被分为五代——每一次迭代都纳入了增强功能，例如双重共刺激信号、细胞因子释放模块或可诱导的转录控制。
中等亲和力、人源化的scFv可以最大限度地减少强直信号传导并降低脱肿瘤激活的风险，而优化的铰链和跨膜域则提高了循环T细胞中受体的稳定性和表达效率。更重要的是，这些进展为下一代CAR结构的设计提供了信息，这些结构结合了多路复用信号组件、可调表达系统和生物标志物响应性启动机制。
临床开发前景与临床前验证
将活体CAR-T细胞疗法从概念验证模型转化为临床应用需要在小型和大型动物系统中进行验证。临床前研究表明，CD3靶向的慢病毒载体可以在体内重编程T细胞而无需体外操作。在人源化小鼠中单次静脉注射此类载体，成功生成了CD19特异性CAR-T细胞，导致持续的B细胞耗竭和肿瘤消退。
AAV载体同样实现了人类T细胞的体内重编程，产生了能够介导异种移植模型中肿瘤清除的功能性CAR-T细胞。用抗CD3或抗CD7抗体装饰的LNP制剂也实现了CAR mRNA向T细胞的选择性递送，实现了有效的B细胞耗竭和强大的体内转染。此外，基于EV的系统允许使用CRISPR–Cas9核糖核蛋白复合物在体内对T细胞进行精确的基因组编辑。
这些技术进步使病毒和非病毒平台——特别是LNPs——成为不仅有前途的T细胞工程递送系统，也是更广泛的免疫干预的有前途的递送系统。不断增长的证据基础支持了活体CAR-T生成的临床可行性，并强调了能够克服现有体外制造障碍的递送模式的出现。
拓展活体细胞工程的转化前景
活体细胞工程领域正在迅速超越传统的CAR-T范畴，探索利用自然杀伤（NK）细胞、巨噬细胞（CAR-M）和树突状细胞（DC）作为治疗载体。这些平台利用了先天免疫细胞的固有细胞毒性或抗原呈递能力，为针对实体瘤和免疫抑制性微环境的治疗提供了新的途径。
尽管前景广阔，活体CAR-T策略的临床转化仍面临重大障碍。靶向特异性不足可能导致脱靶效应和对非目标组织的毒性。载体相关的免疫原性可能引发中和抗体，限制重复给药并降低疗效。制造可扩展性、长期安全性和监管框架是确保该模式广泛临床采用的关键考虑因素。
随着该领域的成熟，活体CAR-T策略可能解锁肿瘤学和自身免疫疾病中更广泛的治疗应用，重新定义细胞免疫疗法的可及性和精确性。
