《BMC Methods》：Road map for primary hepatocyte qualification in human liver organ models
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本综述构建了原代肝细胞分阶段评估框架，通过细胞活力、肝特异性功能（CYP3A4/尿素/白蛋白）及MASLD表型诱导等5个维度筛选，显著提升肝芯片（MPS）建模的再现性与疾病相关性，为精准医疗提供标准化细胞资源筛选方案。
背景
随着美国食品药品监督管理局（FDA）推动减少动物实验依赖，微生理系统（Microphysiological Systems, MPS）作为模拟人体器官功能的先进工具，在药物研发和疾病建模领域日益重要。其中，肝脏MPS（又称肝芯片）通过整合微流控、三维细胞培养和仿生微环境，可重现肝脏关键结构与功能，用于药物代谢（ADME-TOX）研究、慢性疾病建模及精准医疗。然而，MPS的性能高度依赖于所用细胞的质量与适用性，而当前缺乏针对疾病特异性应用（如代谢功能障碍相关脂肪肝病，Metabolic Dysfunction-Associated Steatotic Liver Disease, MASLD）的系统性细胞筛选标准。
材料与方法
本研究针对MASLD建模需求，开发了分阶段评估原代肝细胞（Primary Human Hepatocytes, PHHs）的标准化流程。评估涵盖五大核心阶段：
- 1.
细胞形态与贴壁能力：通过明场成像评估细胞贴壁后24小时的"铺路石样"形态，要求贴壁效率>70%且细胞间连接清晰（图2）。
- 2.
生存能力与稳定性：监测8天培养期内乳酸脱氢酶（LDH）释放量（需<2500 ng/day/10? cells），并通过Calcein-AM染色验证活细胞覆盖率≥80%（图3）。
- 3.
肝特异性功能：评估尿素合成（≥20,000 ng/day/10? cells）、白蛋白分泌、CYP3A4酶诱导（利福平处理后活性需提升3倍以上）及胆管功能（CMFDA染色阳性面积≥2%）（图4-6）。
- 4.
MASLD表型诱导：在正常禁食（NF）、早期代谢综合征（EMS）和晚期代谢综合征（LMS）培养基中，量化脂质蓄积（LipidTOX染色）和纤维化标志物（胶原蛋白Iα1, COL1A1）表达（图7-8）。
- 5.
再现性验证：采用组内相关系数（Intraclass Correlation Coefficient, ICC）评估关键指标在独立实验中的一致性，要求ICC≥0.8为优秀再现性（图9）。
结果
通过四批次原代肝细胞（HU8391、HU8408、HU8449、HU8450）的系统评估，发现：
- •
细胞形态学：批次1045表现出典型铺路石样结构，而批次1133贴壁能力显著不足（图2B）。
- •
功能指标：批次8450在尿素合成、CYP3A4诱导和白蛋白分泌中表现最优，且在不同培养基条件下维持稳定功能（图4-6）。
- •
疾病表型：EMS/LMS培养基显著诱导脂质蓄积（图7），其中批次8442在LMS条件下脂质蓄积异常升高，提示该批次不适用于健康组织建模。
- •
纤维化进展：LX-2星状细胞在EMS条件下被激活，COL1A1分泌显著增加，但α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）表达存在批次间差异（图8）。
- •
再现性：最终筛选的批次8450在关键指标（白蛋白、尿素、LDH、COL1A1）中均表现出优秀再现性（ICC>0.8）。
讨论
该评估框架首次将"适用性"（Fit-for-Purpose）原则系统应用于肝细胞筛选，通过量化功能指标与疾病表型的关联性，解决了传统MPS模型因细胞批次差异导致的再现性问题。研究证实，原代肝细胞的遗传背景和代谢特征显著影响MASLD表型诱导效率，例如某些批次在正常培养基中已存在基础脂质蓄积，提示其不适合用于疾病建模。未来需结合多组学技术进一步解析细胞-微环境相互作用机制，并建立跨实验室标准化数据库以推动精准医疗应用。
结论
分阶段评估框架通过整合细胞活力、功能表型和疾病诱导能力等多维指标，显著提升了肝脏MPS模型的可靠性与临床相关性。该策略不仅为MASLD研究提供了标准化细胞资源筛选方案，其模块化设计也可扩展至其他肝脏疾病模型或干细胞衍生肝细胞的评估，对推动器官芯片技术从基础研究向临床转化具有重要意义。
