秀丽线虫凋亡激活蛋白EGL-1 BH3-only的线粒体定位及其体内合成与降解的动态调控：依赖CED-9 BCL-2的分子机制揭示

《CELL DEATH AND DIFFERENTIATION》：Tagging of C. elegans apoptosis activator EGL-1 BH3-only reveals CED-9 BCL-2-dependent mitochondrial localization and dynamic control of EGL-1 synthesis and degradation in vivo

线虫细胞凋亡关键激活因子EGL-1蛋白的体内时空动态及其调控机制尚不清楚。研究人员通过CRISPR-Cas技术内源性标记EGL-1，首次在活体中揭示了EGL-1 BH3-only蛋白依赖CED-9 BCL-2定位于线粒体，并发现其蛋白水平在注定死亡细胞的母细胞与子细胞中存在快速清除与重新合成的精妙动态控制，深化了对体内凋亡激活多层次调控的理解。

　　

在生命体的发育过程中，细胞程序性死亡（凋亡）如同一位精准的雕塑家，负责清除那些“多余”或不再需要的细胞，从而塑造出健康的组织和器官。这项精密工作的核心执行者之一，是一类被称为BH3-only的蛋白质，它们是细胞凋亡的关键激活开关。在线虫^{Caenorhabditis elegans}这一经典的模式生物中，EGL-1蛋白正是这样一个至关重要的BH3-only凋亡激活因子。然而，尽管科学家们早已知道EGL-1对启动凋亡必不可少，并且它能与抗凋亡蛋白CED-9（BCL-2家族成员）在体外结合，但关于EGL-1在活生生的生物体内究竟身处何处、何时出现又何时消失，以及这些动态过程如何被精确调控，一直笼罩在迷雾之中。EGL-1蛋白是否真的如其哺乳动物“亲戚”那样定位在线粒体上？它在注定要死亡的细胞及其母细胞中是否存在？其蛋白水平的波动是否与细胞命运决定息息相关？解答这些问题，对于完整描绘凋亡激活的体内动态图谱至关重要。

为了解决这些悬而未决的问题，一个研究团队在《细胞死亡与分化》（CELL DEATH AND DIFFERENTIATION）期刊上发表了一项突破性研究。他们巧妙地运用基因编辑与先进的活体成像技术，如同为EGL-1蛋白装上了“荧光追踪器”和“信号放大器”，首次在活体线虫中实时、原位地窥探了EGL-1蛋白的行为，揭示了其依赖于CED-9的线粒体定位以及在其合成与降解层面令人惊讶的动态控制。

为了开展这项研究，作者主要运用了以下几项关键技术：首先，他们利用CRISPR-Cas₁₂基因编辑技术，在线虫的^egl-1基因位点进行内源性修饰，分别构建了携带单体StayGold荧光蛋白（mSG）标签或18个SunTag肽串联标签的基因工程线虫株。其次，针对SunTag系统，他们通过MosSCI（位点特异性单拷贝整合）技术构建了在特定细胞谱系（Q谱系）中表达单链抗体-红色荧光蛋白（scFv-mScarlet）的报告基因株，用于放大并可视化低丰度的EGL-1蛋白信号。最后，研究综合运用了宽场显微镜、配备Airyscan²探测器的超分辨率共聚焦显微镜，并结合TMRE线粒体染料染色、长时程活体成像以及微流控芯片幼虫固定技术，在胚胎和幼虫期对目标细胞进行了高分辨率、定量化的时空动态观测。

研究结果

EGL-1的线粒体定位依赖于CED-9 BCL-2

研究人员发现，携带mSG标签的内源性EGL-1蛋白（mSG::EGL-1）在活体胚胎细胞中呈现出典型的管状网络结构，与线粒体染料TMRE的信号完美共定位。当与携带mScarlet标签的CED-9蛋白（mScarlet::CED-9）共表达时，两者也呈现显著共定位。至关重要的是，在^ced-9功能缺失的突变体中，EGL-1失去了线粒体定位模式，转而弥散在细胞质中，而^ced-3（caspase）突变并不影响此定位。这直接证明了在体内，EGL-1 BH3-only蛋白定位于线粒体，并且这一过程严格依赖于抗凋亡蛋白CED-9 BCL-2。

EGL-1蛋白在注定死亡细胞及其母细胞中的存在与动态

与广泛表达的CED-9、CED-4（APAF-1）和CED-3（Caspase）不同，EGL-1蛋白的表达具有高度空间限制性。在胚胎中，mSG::EGL-1仅出现在少数细胞中，其中包括可通过差异干涉反差（DIC）识别的凋亡细胞（细胞尸体），以及一些非凋亡细胞——后者被推测为注定死亡细胞的母细胞。这证实了EGL-1蛋白在凋亡级联反应的最上游细胞中即有存在。

胚胎NSM神经谱系中EGL-1蛋白的快速清除与重新合成

通过对胚胎中NSM神经母细胞（NSMnb）谱系的实时超分辨率成像，研究人员观察到了EGL-1蛋白水平的剧烈动态变化。在NSMnb分裂前，其内部的EGL-1蛋白信号迅速消失，至细胞分裂中期时几乎检测不到。分裂后，EGL-1蛋白特异性地在注定死亡的小女儿细胞（NSMsc）中快速重新出现并积累，而在存活的姐妹细胞（NSM）中则始终没有出现。定量分析显示，NSMsc中的EGL-1蛋白信号强度显著高于其母细胞分裂中期或存活姐妹细胞。

幼虫QL.p神经谱系中EGL-1的线粒体共定位与出现时间影响死亡速度

在幼虫的QL.p神经母细胞谱系中，借助SunTag信号放大系统，研究人员成功检测到了在QL.p母细胞及其存活子细胞中难以察觉的EGL-1蛋白。在注定死亡的子细胞QL.pp中，EGL-1蛋白一经出现便主要（约90%）与线粒体共定位。分析发现，EGL-1在QL.pp中出现的时间点（而非出现量）与其存活时间（即从出现到死亡的时间）呈负相关，即EGL-1出现越早，细胞死亡越快。

研究结论与意义

这项研究通过精密的活体成像，首次提供了EGL-1 BH3-only蛋白在^{C. elegans}体内行为的直接可视化证据，并得出了几个核心结论：

1. 1.
   定位机制：EGL-1蛋白在体内定位于线粒体，并且该定位严格依赖于其相互作用蛋白CED-9 BCL-2。这支持了EGL-1通过直接结合线粒体上的CED-9来触发CED-4（APAF-1）重新组装并激活CED-3 Caspase的凋亡激活模型。
2. 2.
   时空表达：EGL-1蛋白的表达严格限定于“死亡谱系”细胞，在胚胎中同时存在于注定死亡细胞及其母细胞内，但在幼虫谱系中仅在死亡子细胞中被清晰检测到，提示可能存在谱系特异性差异。
3. 3.
   动态调控：EGL-1蛋白的水平受到转录后和翻译层面的动态精细调控。在母细胞分裂前，EGL-1蛋白被快速降解，以防止其被错误地遗传给存活的子细胞；而在注定死亡的子细胞中，EGL-1蛋白被快速重新合成，以迅速启动凋亡程序。这种“先清除，后特异地重建”的模式，是确保不对称细胞分裂后细胞命运正确分化的关键一层保障。
4. 4.
   功能关联：EGL-1蛋白在死亡子细胞中出现的时间，直接影响细胞死亡的执行速度，强调了其合成动态在凋亡进程定时中的重要性。

该研究的深远意义在于，它将我们对细胞凋亡激活的理解从静态的基因和蛋白质相互作用，推进到了活体、实时、高分辨率的动态调控层面。它不仅证实了长期以来基于生化实验的推测，更揭示了此前未知的、在蛋白质合成与降解水平对BH3-only蛋白活性的精妙时空调控。这些发现拓展了凋亡激活的调控维度，为理解正常发育和肿瘤发生中细胞死亡命运的精确决定提供了新的理论框架。研究所建立的内源性蛋白标记与活体成像方法，也为在复杂生命系统中研究其他低丰度、动态变化的关键调控蛋白提供了强大的技术范本。