《Frontiers in Microbiology》：Synergistic effects of Bacillus spp. and graphene oxide on nutrient cycling and soil health in peach tree rhizospheres
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本研究通过探究芽孢杆菌（Bacillus velezensis 与 Bacillus subtilis）与氧化石墨烯（GO）单一及复合处理对病态桃树根际的影响，揭示了“微生物-GO”组合通过“元素平衡-微生物群落功能”联动的根际生态修复机制，为桃树土传病害的绿色防控提供了基于健康微生态目标的策略与理论依据。
1 引言
桃树作为重要的经济果树，在种植过程中常受到多种病害威胁，其中炭疽病（主要由Colletotrichum acutatum与Colletotrichum gloeosporioides引起）因其传播快、危害严重而备受关注。传统化学农药虽有一定防控效果，但其广泛应用仍受限制。近年来，新型农业技术、纳米材料与微生物制剂在植物病害防控领域展现出巨大潜力。氧化石墨烯作为一种典型的二维纳米材料，具有优异的抗菌性、良好生物相容性与环境稳定性，可影响微生物群落的生长。同时，具有抑菌活性的微生物液剂（如芽孢杆菌）作为环境友好策略，能通过营养竞争、抗生素产生或吸附降解毒素等机制抑制病原菌生长。然而，目前研究多集中于单一材料在单一体系中的作用，当芽孢杆菌与GO共同施用于病态果树根际时，二者间的相互作用尚不明确。
本研究以病态桃树根系及根际土壤为研究对象，探究氧化石墨烯与芽孢杆菌（Bacillus velezensis和Bacillus subtilis）微生物制剂对桃树炭疽病的防控效果，并首次将芽孢杆菌与GO结合，分析不同处理对桃树根际土壤理化性质与微生物群落结构的影响。研究假设GO与微生物制剂的复合处理能够改善土壤理化性质，提升根际微生物群落多样性，为桃树炭疽病的绿色防控提供科学依据。
2 材料与方法
2.1 实验设计
本研究所用氧化石墨烯购自上海源叶生物科技有限公司，所用菌株Bacillus velezensis与Bacillus subtilis源自成都大学微生物保藏中心。实验地点位于中国四川省龙泉山地区。于2024年5月对病态桃树进行两次液体菌剂灌施，并于2024年7月进行根际土壤与植物根系采样。采样时去除0-5 cm表土，抖落根系松散土壤，用无菌刷收集附着于根系的土壤作为根际土壤。
实验设置8种处理组：V组（Bacillus velezensis 300 mL）、S组（Bacillus subtilis 300 mL）、L组（250 mg/L GO 300 mL）、H组（1000 mg/L GO 300 mL）、VL组（Bacillus velezensis与250 mg/L GO各150 mL）、VH组（Bacillus velezensis与1000 mg/L GO各150 mL）、SL组（Bacillus subtilis与250 mg/L GO各150 mL）、SH组（Bacillus subtilis与1000 mg/L GO各150 mL）。以健康桃树根际土壤为空白对照（CK1），病态桃树根际土壤为病害对照（CK2）。
2.2 土壤理化性质测定
采用玻璃电极法测定土壤pH；重铬酸钾氧化-外加热法测定土壤有机碳（OC）；凯氏定氮法测定全氮（TN）；钼锑抗比色法测定全磷（TP）与有效磷（AP）；火焰光度法测定全钾（TK）与速效钾（AK）；碱解扩散法测定碱解氮（AN）；四酸消解-电感耦合等离子体质谱法测定土壤中多元素含量。
2.3 DNA提取与PCR扩增
采用SDS法提取根系内生细菌、根际土壤细菌与真菌的基因组DNA。以稀释后DNA为模板，使用引物515F/806R扩增细菌16S rRNA基因V4高变区，使用引物ITS5-1737F/ITS2-2043R扩增真菌ITS片段。利用NEBNext?Ultra? II DNA Library Prep Kit构建文库，经Qubit与Q-PCR定量分析后，在NovaSeq6000平台上进行测序。
2.4 16S rRNA与ITS测序数据分析
通过barcode与引物序列拆分数据，使用FLASH拼接原始标签获得reads，经fastp软件过滤后得到clean tags。将clean tags与物种注释数据库进行比对以去除嵌合序列，获得最终有效标签。利用QIIME2软件中DADA2模块进行降噪，得到ASVs，并对各ASV代表序列进行物种注释与系统发育树构建。
2.5 芽孢杆菌菌株鉴定与全基因组测序分析
采用16S rRNA基因测序对两株芽孢杆菌进行鉴定，通过NCBI数据库BLAST比对并构建系统发育树。通过SDS法提取基因组DNA，分别使用Oxford Nanopore PromethION与Illumina NovaSeq 6000平台进行测序，经质量控制、de novo组装与纠错后，进行基因组结构分析与功能注释，并利用circlize R包绘制基因组环状图。
2.6 数据分析
采用SPSS 23.0进行单因素方差分析与LSD事后检验；利用QIIME2计算alpha多样性指数；基于未加权Unifrac距离进行PCoA与NMDS分析；通过PICRUSt2与FUNGuild进行微生物功能预测；采用Pearson相关分析环境因子与微生物群落间的关联。
3 结果
3.1 土壤理化性质变化
除CK2外，所有样品土壤pH均呈弱碱性。SH组pH最低（8.1），最接近中性。与CK2相比，V处理使土壤pH显著降低10.84%。V组有机碳含量最高（26.43 g/kg）。CK2组钙（Ca）含量显著高于其他组（达42.17 g/kg），而V、S、L与SL组钙含量较低（<13 g/kg）。CK2组锌（Zn）含量显著高于其他组，铁（Fe）与镁（Mg）含量组间差异较小。CK2组全氮、全钾、速效钾、全磷与有效磷含量均显著高于其他组。与CK2相比，V处理使土壤碱解氮、有效磷与速效钾分别降低32.90%、80.17%与51.43%，数值更接近CK1组。L组全氮与碱解氮含量最低。
3.2 微生物群落组成
高通量测序分析显示，稀释曲线在测序读长达到20,000后趋于平稳，表明测序深度足够。在97%相似度下，共获得内生细菌7,814个ASVs、根际土壤细菌11,501个ASVs与真菌8,725个ASVs。
在门水平上，内生细菌以蓝细菌（Cyanobacteria）、变形菌门（Proteobacteria）与放线菌门（Actinobacteria）为主，其中蓝细菌占比最高（54.93%）。土壤细菌群落主要包括变形菌门（31.43%）、酸杆菌门（Acidobacteria，17.53%）与泉古菌门（Crenarchaeota，18.48%）。与CK1相比，CK2组变形菌门丰度最低，其余处理组变形菌门丰度均有所上升。土壤真菌中，子囊菌门（Ascomycota）占比最高（57.57%），其次为Fungi_phy_Incertae_sedis（3.19%）、GS01_phy_Incertae_sedis（2.81%）与担子菌门（Basidiomycota，2.71%）。
在属水平上，内生细菌以unidentified_Chloroplast（54.83%）与unidentified_Mitochondria（15.95%）为主。土壤细菌中，鞘氨醇单胞菌属（Sphingomonas，5.15%）、RB41（2.52%）与假单胞菌属（Pseudomonas，1.26%）占比较高。CK2组鞘氨醇单胞菌属与RB41丰度最低，而各处理组鞘氨醇单胞菌属丰度均较CK1有所增加。土壤真菌属水平丰度在各处理组间存在差异：CK1中以Plectosphaerella为主，CK2中以镰刀菌属（Fusarium）为主，L组则以青霉属（Penicillium）为主。
3.3 微生物群落多样性
α多样性分析显示，对于内生细菌，V、S与H组的Shannon与Simpson指数高于其他处理组，而CK2组的Shannon与Simpson指数最低。土壤细菌的α多样性指数在各处理间无显著差异。对于土壤真菌，V组的Shannon指数显著高于VH组，SL组的Shannon指数显著高于SH组。V组与SL组的Simpson指数最高，且显著高于CK1、L、VH与SH组。
基于属水平的PCoA分析与未加权Unifrac距离的NMDS分析显示，对于内生细菌，PC1与PC2分别解释56.96%与15.77%的变异，除V组与SH组外，组间群落相似性较高。对于土壤细菌，PC1与PC2分别解释50.34%与17.15%的变异，V、S与H组存在部分重叠。对于土壤真菌，PC1与PC2分别解释24.29%与13.43%的变异，SL组样品相对聚集，但与其他组距离较大。
3.4 相关性分析
Pearson相关分析显示，根系细菌结构与钙、镁、全磷呈显著负相关。土壤细菌中的假单胞菌属、寡养单胞菌属（Stenotrophomonas）、无色杆菌属（Achromobacter）、溶杆菌属（Lysobacter）与莱茵海默氏菌属（Rheinheimera）与碱解氮、有效磷、速效钾呈显著正相关，而Longimicrobium与土壤pH、有机碳、铁、镁呈显著负相关。土壤真菌中的青霉属与钙、全磷、碱解氮、有效磷、速效钾呈显著负相关，Arxiella、Apiospora与Solicoccozyma与土壤pH呈显著正相关。
3.5 微生物群落功能富集
基于PICRUSt2的细菌功能预测显示，根系内生细菌中，CK2组的内切酶、Uma2家族与DNA结合反应调节蛋白功能高于CK1组。V组的DNA结合反应调节蛋白功能增强。SH组的NAD(P)依赖型脱氢酶与参与细胞壁生物合成的糖基转移酶功能减弱。土壤细菌中，参与细胞壁生物合成的糖基转移酶、核苷二磷酸糖差向异构酶等功能较强，而DNA结合反应调节蛋白、预测的阿拉伯糖外排渗透酶等功能较弱。与CK1相比，CK2组的DNA结合反应调节蛋白功能增强，丙二酰-ACP甲酯羧酸酯酶与信号转导组氨酸激酶功能减弱。VL组的预测阿拉伯糖外排渗透酶功能增强，L组的DNA定向RNA聚合酶特异性σ亚基功能增强。
基于FUNGuild的真菌功能预测显示，土壤真菌功能可分为35类，其中未分配功能占比最大（60.46%），其次为未定义腐生菌、植物病原菌-土壤腐生菌-木材腐生菌与植物病原菌。与CK1相比，所有组的真菌寄生虫丰度均较低；CK2组的植物病原菌-土壤腐生菌-木材腐生菌丰度显著降低；V组的植物病原菌丰度显著升高；H组的动物病原菌与植物病原菌-未定义腐生菌丰度显著升高；SH组的未定义腐生菌与动物病原菌-内生菌-植物病原菌-木材腐生菌丰度显著升高。所有土壤样品的营养模式可分为10类，其中未分配模式占比最大（60.24%），其次为腐生型、病原-腐生型、病原型与病原-共生型。与CK1相比，CK2组真菌以病原型为主，L组真菌为病原-腐生-共生型，VH组真菌主要为腐生-病原-共生型。
3.6 芽孢杆菌鉴定与全基因组测序
16S rRNA测序与系统发育分析显示，两株菌分别为Bacillus subtilis（与NR 027552.1相似度99.73%）与Bacillus velezensis（与NR 116240.1相似度99.93%）。两菌株的完整基因组序列已提交至NCBI数据库。通过全基因组测序构建了Bacillus subtilis与Bacillus velezensis的基因组圈图。
4 讨论
4.1 微生物制剂处理有效调控病态桃树根际土壤理化性质
本研究发现，芽孢杆菌可能通过代谢活动或分泌有机酸等机制降低土壤碱度。SH组（Bacillus subtilis与1000 mg/L GO复合处理）对降低土壤pH效果最显著。V组与S组的pH显著低于CK2，且接近CK1组的弱碱性范围。V组有机碳含量在所有处理组中最高，而SL组与VH组的有机碳含量较低，可能与GO添加抑制微生物活性有关。CK2组的钙、锌、镁含量显著高于其他组，可能因病原分泌物严重损害桃树根系，导致养分吸收率降低并在根际累积。经Bacillus velezensis或Bacillus subtilis单一处理后，土壤钙、锌、镁含量显著降低，这两种芽孢杆菌作为植物根际促生菌，可能增强了病态桃树根系功能，促进植物对养分的吸收与转运。GO与微生物复合处理后，土壤锌含量接近健康桃树CK1组水平。CK2组全氮、全磷、全钾含量显著高于其他组，而V组与S组三者含量相对较低。V处理使有效磷与速效钾含量较CK2分别降低80.2%与51.4%，有利于使病态桃树土壤恢复正常。低浓度GO可能通过抑制尿素水解减缓土壤氮循环，导致L组全氮与碱解氮含量下降。SH组的有效磷与速效钾含量显著升高，可能因芽孢杆菌通过产生有机酸与分泌特定酶增强土壤磷、钾的生物有效性。
4.2 微生物制剂处理调控并重塑微生物群落以促使其功能向健康状态转变
植物、土壤与微生物群落紧密关联。本研究中，添加芽孢杆菌菌剂提高了根系内生细菌与根际真菌的α多样性指数。较高微生物多样性更利于维持土壤健康与促进植物生长。低浓度GO处理降低了根系内生细菌与土壤真菌的α多样性，可能因其直接理化毒性干扰了敏感微生物。有趣的是，高浓度GO处理组的内生细菌多样性指数高于低浓度组，可能因高浓度GO颗粒更易聚集，降低了直接生物毒性。所有复合处理均提高了本土细菌群落的Shannon指数，但对土壤真菌与细菌多样性的影响各异。
在微生物群落组成方面，内生细菌群落中，CK2组蓝细菌丰度最高，植物可能通过招募固氮菌应对病害胁迫以维持生长需求。各处理组变形菌门、放线菌门与链霉菌属丰度均较CK2增加，其中SH组的假单胞菌属丰度增加最多，这些菌群可通过抑制病原菌生长促进植物生长。微生物制剂的使用改变了根际土壤细菌群落多样性，并对根际细菌结构产生积极影响。然而，添加菌剂并未显著改变土壤中芽孢杆菌属的丰度，可能与本土微生物群落与引入有益微生物间的竞争有关。与CK2相比，各处理组变形菌门丰度下降，而酸杆菌门与泉古菌门丰度上升，二者分别在硫、氮循环与维持生态系统物质循环方面具有重要作用。处理后，各处理组土壤细菌中鞘氨醇单胞菌属丰度均较CK1增加，该菌属有助于支持植物生长并提升生产力。L组的RB41丰度最高，该菌与有机质分解及碳循环密切相关。
土壤真菌群落的变化因处理组而异。与CK2相比，经菌剂处理后V组与S组的Arxiella丰度增加，L组的青霉属丰度显著上升，该菌属可分解土壤复杂有机质并产生抗生素抑制病原菌。相关性分析显示，土壤理化性质的变化对根际细菌影响更显著，多数理化参数与细菌丰度呈正相关。根系内生细菌与大多数理化指标呈负相关，仅少数指标与土壤真菌丰度显著相关。
微生物群落功能方面，CK2组内生细菌的DNA修复与反应调节蛋白功能显著增强，可能反映微生物群落在病害胁迫引发的根际逆境中为生存进行的自我调节。根际细菌中，CK2组同样表现出环境响应功能增强以提升植物抗逆性。不同处理后，细菌功能更接近健康植物CK1组，尤其是VH组与L组。L组增强的核苷二磷酸糖差向异构酶与NAD(P)依赖型脱氢酶功能分别参与糖核苷酸转化与有机化合物分解产能，均有利于植物生长。真菌的功能组成与营养模式在各处理组间差异显著：CK2组病原型占比较高，表明病害土壤中病原真菌可能占主导；L组与VH组分别以病原-腐生-共生型与腐生-病原-共生型为主，提示共生型在根际土壤真菌群落稳定性中起重要作用，这些处理可能促使真菌群落向更平衡的生态功能转变，有助于恢复土壤健康。
5 结论
本研究分析了芽孢杆菌菌剂、氧化石墨烯及其复合处理对病态桃树根际土壤理化性质与微生物群落的影响。不同处理在一定程度上缓解了病害对桃树的胁迫。菌剂处理增加了桃树根系微生物多样性，并使根际土壤理化性质与微生物群落功能趋于正常。这些变化可能直接影响土壤养分循环，为桃树生长提供新环境，并通过改变内生细菌共同促进其发育。GO处理效果因其浓度而异：高浓度GO增强微生物多样性，低浓度GO则降低微生物多样性。复合处理中，Bacillus velezensis与GO的协同作用尤为突出，通过土壤理化参数优化与微生物功能模块重组，构建了更完整的根际微生态网络。本研究不仅从“元素循环-微生物互作”维度阐明了生物杀菌剂缓解桃树土传病害的作用机制，还创新性提出了GO-微生物复合调控策略，为桃树根际生态修复提供了可量化的贡献，深化了对植物-微生物-土壤互作网络的理论认知。
