《Frontiers in Immunology》：The role of soluble toll-like receptor-2 and 4 in children with pneumonia: a combined analysis of saliva and serum samples
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本文创新性地同时分析了儿童社区获得性肺炎（CAP）患者唾液与血清中的可溶性Toll样受体-2与4（sTLR-2/4）及其它细胞因子水平。研究发现，唾液中的sTLR-2、sTLR-4和肿瘤坏死因子-α（TNF-α）是区分肺炎患儿与健康儿童、以及预测需要住院的严重病例的潜在非侵入性生物标志物，其诊断价值优于血清分析，为儿童肺炎的无创精准诊断提供了新方向。
1 引言
肺炎是全球儿童死亡的重要原因。然而，儿童社区获得性肺炎（CAP）在诊断和治疗方面仍存在诸多信息缺口。传统的生物标志物，如血清降钙素原（PCT）和C反应蛋白（CRP），在诊断严重肺炎中虽常用，但仍缺乏用于儿童CAP高效管理的有效诊断生物标志物。Toll样受体（TLRs）是先天免疫的关键传感器，其中TLR-2和TLR-4在识别病原体相关分子模式、启动炎症反应中扮演核心角色。其可溶形式（sTLRs）通过膜结合受体的蛋白水解脱落释放到生物体液中，可作为诱饵受体调节炎症反应。本研究旨在通过联合分析儿童CAP患者的唾液和血清样本，评估sTLR-2、sTLR-4及相关细胞因子作为诊断和分层生物标志物的潜力。
2 材料与方法
本研究为一项单中心前瞻性病例对照研究，招募了2020年7月至2021年7月期间就诊的1个月至18岁的CAP患儿。患者分为住院组（n=43）和门诊组（n=24），并设立了年龄性别匹配的健康对照组（n=22）。收集血清和唾液样本（部分患者），在诊断时进行分析。血清样本使用ELISA试剂盒检测白细胞介素（IL）-1β、IL-4、IL-6、IL-10、干扰素（IFN）-α、肿瘤坏死因子（TNF）-α以及可溶性TLR-2和TLR-4的水平。唾液样本通过实时逆转录聚合酶链式反应（RT-PCR）分析上述细胞因子及TLR-2和TLR-4的mRNA表达水平，以β-肌动蛋白（ACTB）为内参基因，采用2-ΔΔCt方法计算相对表达量。统计分析包括组间比较、受试者工作特征（ROC）曲线分析等。
3 结果
3.1 肺炎患者的临床特征
住院患者的中位年龄为28个月，门诊患者为41.5个月。住院患者更常出现呼吸费力和呼吸急促症状。在病原学方面，67%的患者检测到病毒病原体，其中人鼻病毒（n=20）和SARS-CoV-2（n=17）是主要病毒。
3.2 血清分析结果
在不进行年龄分层的情况下，住院患者、门诊患者和对照组之间的血清细胞因子水平无显著差异。
然而，在按年龄（0-1岁、1-5岁、6-18岁）分层后，双因素方差分析揭示了显著的年龄效应。在住院患儿中，婴儿（0-1岁）的IL-6、TNF-α、IFN-α、IL-1β、IL-4、IL-10和sTLR-4水平均显著高于6-17岁的住院患儿。
对病毒亚组的分析揭示了不同的免疫模式。人鼻病毒肺炎表现出广泛的免疫激活，其IFN-α、IL-1β、IL-4、IL-10、TNF-α、TLR-2和TLR-4水平均显著高于对照组。相比之下，SARS-CoV-2肺炎则表现出选择性反应模式：IL-1β、IL-4、IL-10和TNF-α升高，但IFN-α、IL-6和TLR-4水平显著低于对照组。
3.3 唾液分析结果
在唾液样本中，住院患者的TLR-2和TLR-4的mRNA表达水平（2-ΔΔCt）均显著高于健康对照组，分别有约4倍的升高。促炎细胞因子IL-6、IL-10、IFN-α和TNF-α在住院患者中也显著高于对照组，其中TNF-α的差异最为显著（>10倍升高）。门诊患者的表达水平通常介于住院患者和对照组之间。
3.4 ROC分析
在区分需要住院的CAP方面，唾液生物标志物显示出良好的预测能力。唾液sTLR-2的曲线下面积（AUC）为0.757，最佳阈值为1.970 2-ΔΔCt；唾液sTLR-4的AUC为0.768，最佳阈值为2.350 2-ΔΔCt；而唾液TNF-α的AUC最高，为0.833，具有优秀的预测准确性，其最佳阈值为3.665 2-ΔΔCt。在最优阈值下，唾液TNF-α的敏感性为84.2%，特异性为73.3%。相比之下，血清生物标志物在预测住院需求方面没有表现出显著的区分能力。
此外，唾液IL-6的特异性最高（76.7%），而IL-1β的敏感性最低（47.4%）。
3.5 临床症状、实验室参数与细胞因子的相关性
在住院患者中，唾液sTLR-2和sTLR-4水平与喂养困难、食欲不振和烦躁不安等临床症状呈显著正相关。血清细胞因子之间存在强正相关性，表明存在协调的炎症反应。
4 讨论
本研究首次在儿童肺炎中同时分析了唾液和血清中的sTLR-2和sTLR-4。研究发现，与健康对照组相比，下呼吸道感染儿童的TLR-2和TLR-4水平显著升高，且在重症肺炎患儿中更高。唾液中的sTLR-2、sTLR-4和TNF-α被证明是区分肺炎患儿与健康儿童、以及预测住院需求的潜在优秀生物标志物，其诊断效能优于血清分析。这凸显了唾液作为一种非侵入性采样方法在儿科群体中的巨大价值，特别是在采血困难的情况下。
年龄分层分析揭示，1岁以下婴儿的IL-6和TNF-α等细胞因子水平显著高于年长儿童，提示年幼儿童在肺炎期间可能具有更强烈或失调的先天免疫反应，这或许是其疾病严重程度和住院率较高的原因之一。
研究还观察到不同病毒病原体引发的免疫反应存在差异。人鼻病毒感染引发了广泛的免疫激活，而SARS-CoV-2感染则表现出一种更具选择性的反应模式，其IFN-α、IL-6和TLR-4水平低于对照组。这提示不同病毒可能利用不同的免疫致病机制。
尽管存在研究局限性，如样本量受COVID-19大流行防控措施影响、单中心设计以及无法收集SARS-CoV-2阳性患者的唾液样本等，但本研究结果为利用唾液生物标志物无创诊断和评估儿童肺炎严重程度提供了有力的初步证据。未来研究可进一步探索针对TLR通路的新型激动剂或拮抗剂药物在儿童CAP治疗中的潜在应用，这将为改善儿童肺炎的临床管理策略开辟新途径。
