《Plant Biotechnology Journal》：Poplar miR1447 Is a Negative Regulator of Disease Resistance Through the SA-Dependent Pathway
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本研究揭示杨树非保守微小RNA miR1447在抗病中的关键作用。研究发现，miR1447通过靶向切割PopTCTP（Translationally Controlled Tumor Protein）负调控杨树对多种真菌（如Cytospora chrysosperma、Colletotrichum gloeosporioides）和细菌（Lonsdalea populi）病原体的抗性。其作用机制与水杨酸（SA）信号通路密切相关：miR1447及其靶基因PopTCTP的启动子均含有SA响应元件，该模块通过调控SA信号下游关键基因NPR1和PR1的表达、影响MAPK（Mitogen-Activated Protein Kinase）信号以及活性氧（ROS）清除，参与到病原体相关分子模式（PAMP）触发免疫（PTI）以及PTI与效应子触发免疫（ETI）的交叉对话中。研究首次阐明了miR1447-PopTCTP-SA这一新型信号模块在木本植物广谱抗病中的调控网络，为林木抗病分子育种提供了新的遗传靶点。
引言：杨树病害与miRNA的调控角色
杨树是全球广泛分布和适应性强的树种，也是研究分子机制和基因工程育种的模式树种。然而，杨树常遭受溃疡病、炭疽病和锈病等多种病害侵袭。其中，由金黄壳囊孢（Cytospora chrysosperma）引起的杨树溃疡病是一种全球性毁灭性真菌病害，而由革兰氏阴性细菌杨树雷尔氏菌（Lonsdalea populi）引起的新兴溃疡病则给杨树人工林造成巨大损失。炭疽病是一种典型的杨树叶部病害，由胶孢炭疽菌（Colletotrichum gloeosporioides）引起。然而，杨树抗病性的潜在机制在很大程度上仍不清楚。
微小RNA（miRNA）是一类长度20-24个核苷酸的非编码RNA，在植物中普遍存在，在防御生物胁迫中起着至关重要的作用。已有的研究表明，一些保守的miRNA（如Ptc-miR472a和miR159）在杨树应对病原体侵染中扮演重要角色。然而，关于非保守miRNA是否以及如何贡献于杨树抗病性的信息仍然有限。有趣的是，miR1447被证实不存在于拟南芥基因组中，但调控杨树对不同非生物胁迫的响应。此外，小RNA文库分析提示miR1447可能在杨树响应害虫侵染中起关键调节作用。但miR1447在杨树防御病原体中的生物学功能及其分子机制尚待阐明。
水杨酸（SA）及其信号转导被广泛报道参与植物对病原体的免疫。miRNA可以调节激素信号通路的关键组分和激素稳态。多项研究揭示了其他植物中miRNA-SA模块在抗病中的作用。然而，miR1447与SA信号在杨树防御病原体中的关系尚未被揭示。
结果
1. miR1447的表征与表达
组织特异性表达模式分析显示，miR1447在茎中的表达量显著高于其他组织，提示其主要在茎中发挥生物学功能。在不同杨树品种接种杨树雷尔氏菌后，发现miR1447的积累在受感染杨树中大大降低。基于转录组数据库的分析也暗示miR1447在杨树响应杨树雷尔氏菌中具有潜在的调控作用。这些结果表明miR1447在杨树抗病性中具有潜在作用。
2. miR1447过表达削弱而STTM增强杨树对多种病原体的抗性
为了阐明miR1447的生物学功能，在84K杨树中获得了miR1447的过表达（OE）和短串联靶标模拟（STTM）株系。对杨树雷尔氏菌的易感性分析表明，OE株系表现出更严重的病害症状和更长的病斑长度，而STTM株系则表现出相反的趋势，表明miR1447负调控杨树对杨树雷尔氏菌的响应。进一步的病程观察证实了这一点。
对金黄壳囊孢的接种实验也得出类似结论：miR1447-OE株系的病斑长度显著大于野生型（WT），而STTM株系的病斑长度则减小。
此外，对胶孢炭疽菌的接种实验表明，过表达miR1447导致叶片病斑更大，而抑制其表达则导致病斑更小。感染级别百分比、细胞死亡观察、H2O2积累检测以及最大光化学效率（Fv/Fm）分析均一致表明，miR1447是杨树对多种病原体抗性的负调控因子。
3. miR1447调控抗病相关基因的转录水平
对miR1447转基因株系的基因表达谱分析发现，差异表达基因在丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）信号通路、类黄酮生物合成和苯丙烷生物合成通路中富集。分析显示miR1447通过调节MAPK3和MAPK6的表达参与植物免疫，病原感染触发了植物MAPKs磷酸化水平的变化，表明miR1447在PTI/ETI信号中具有调控作用。
活性氧（ROS）参与植物防御。抗氧化酶基因（如SOD、POD、APX、CAT、GPX、GST）在miR1447-OE株系中表达上调，在STTM株系中下调，表明过表达miR1447可能增强杨树的ROS清除能力。外源施用抗坏血酸清除ROS可减轻病斑症状。有趣的是，在SA处理的植株中，抗氧化酶的表达在miR1447-OE株系中下调，在STTM株系中上调，表明SA参与了miR1447对杨树ROS清除的调控。
4. miR1447通过SA信号参与抗病调控
启动子顺式作用元件分析显示，miR1447的结合位点与激素响应、MYB/MYC以及光响应性相关，其中包括SA响应元件。瞬时过表达实验证实miR1447启动子活性受SA处理抑制。
SA信号关键基因非表达病程相关基因1（NPR1）和病程相关蛋白1基因（PR1）的表达分析显示，miR1447负调控NPR1的早期表达（0小时，24小时）和PR1的基础水平表达（0小时），表明miR1447在杨树响应病原体时作为SA信号的负调控因子。使用抑制NPR1介导的SA依赖性植物免疫的药物替诺昔康处理，增加了miR1447转基因株系的感病性，NPR1的表达趋势与未处理时基本一致。
进一步研究发现，在SA处理的WT植株感染胶孢炭疽菌后，miR1447呈现下降表达趋势。值得注意的是，外源SA处理增强了miR1447-OE株系对胶孢炭疽菌的抗性，但降低了STTM株系的抗性。在SA处理的miR1447转基因株系中，SA生物合成主要通过苯丙氨酸解氨酶（PAL）途径而非异分支酸合酶（ICS）途径进行。内源SA含量测定和SA信号基因（NPR1和PR1）的动态表达变化均支持外源SA和SA信号有助于miR1447转基因株系对胶孢炭疽菌的抗性。
转录组深入分析揭示了SA处理下miR1447-OE株系通过上调苯丙烷生物合成、类黄酮生物合成等防御相关通路，以及下调光合作用等消耗能量的通路来增强抗性的分子机制。而SA处理的STTM株系则表现出不同的防御策略。
5. PopTCTP是miR1447的直接靶标并通过SA信号贡献于抗病性
降解组分析鉴定出21个miR1447的候选靶基因，其中PopTCTP（Pop_G10G022958）在两个不同的降解组中均被检测到，切割位点与miR1447的第10和第11个核苷酸互补。瞬时共表达实验证实miR1447切割PopTCTP并导致其降解。PopTCTP在miR1447-OE株系中显著下调，在STTM株系中上调，表达模式与miR1447相反。烟草GFP报告系统实验进一步直观验证了miR1447对PopTCTP的靶向关系。
组织特异性表达显示PopTCTP在顶芽和茎上部表达最高。亚细胞定位分析表明PopTCTP蛋白定位于细胞核和细胞质。系统发育分析显示PopTCTP属于TCTP基因家族，具有保守的TCTP结构域。启动子分析发现PopTCTP含有多个顺式作用调控元件，包括SA响应元件。瞬时过表达实验证明PopTCTP启动子响应外源SA。
表达分析表明，PopTCTP在杨树响应杨树雷尔氏菌和胶孢炭疽菌侵染过程中表达下调。在SA处理的WT植株感染胶孢炭疽菌后，PopTCTP表达呈上升趋势，与miR1447趋势相反。
通过获得PopTCTP同义突变过表达株系和RNAi株系，并分析其表达谱，发现PopTCTP可能通过调节植物-病原体互作、次生代谢物生物合成、苯丙烷生物合成、谷胱甘肽代谢以及MAPK信号通路等参与植物抗病。有趣的是，PopTCTP对MAPK3/6的表达调控作用与miR1447相反，揭示了一个潜在的miR1447-PopTCTP-MAPK三级调控网络。
6. miR1447-PopTCTP模块参与杨树生长和flg22触发的PTI
光合指标分析表明，miR1447可能负调控杨树的基础光合能力和潜在光合能力。PopTCTP过表达株系增加了株高和地径，而RNAi株系则相反，表明PopTCTP可能正向调控杨树生长。一些光合作用相关基因在miR1447和PopTCTP转基因株系中呈现相反的表达趋势。
PTI是植物的一种广谱免疫反应。flg22处理下WT植株中miR1447和PopTCTP的动态表达分析表明，miR1447-PopTCTP模块可能调控杨树中flg22触发的PTI。
7. miR1447-PopTCTP模块可能调控PopTCTP的互作蛋白dnaJ A6
PopTCTP转基因株系接种胶孢炭疽菌的实验表明，PopTCTP可能负调控杨树对胶孢炭疽菌的抗性。通过酵母双杂交筛选和验证，发现PopTCTP与分子伴侣蛋白dnaJ A6存在相互作用。表达分析显示，miR1447正向调控dnaJ A6的表达，而PopTCTP则发挥相反的调控作用。在PopTCTP转基因株系感染胶孢炭疽菌后，dnaJ A6的表达也受到相应调控。此外，dnaJ A6在杨树响应杨树雷尔氏菌和胶孢炭疽菌过程中的表达变化表明其参与杨树免疫。这些结果表明，dnaJ A6作为PopTCTP的互作蛋白，可能受miR1447-PopTCTP模块调控，并参与杨树对多种病原体的响应。
讨论
本研究首次系统阐明了非保守miRNA miR1447在杨树抗病中的负调控作用及其通过SA依赖途径的分子机制。研究发现，miR1447-PopTCTP模块响应SA信号，并通过调控下游SA信号基因、MAPK信号以及ROS动态平衡，参与到PTI以及PTI-ETI交叉对话中，从而影响杨树对多种真菌和细菌病原体的广谱抗性。研究还揭示了该模块在植物生长与防御平衡中的潜在作用。这些发现不仅拓展了对木本植物miRNA抗病调控网络的认识，也为利用miR1447-PopTCTP模块进行杨树乃至其他林木的抗病分子育种提供了重要的理论依据和遗传靶点。
