《Advanced Healthcare Materials》：Patient-Derived 3D Bioprinted Cardiac Organoid Constructs Reveal Key Pathological Features of Duchenne Muscular Dystrophy
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本综述系统介绍了利用杜氏肌营养不良症（DMD）患者来源的诱导多能干细胞（hiPSCs）构建三维（3D）心脏类器官（COs）及其生物打印结构（bCOs）的研究，成功重现了DMD相关心肌病的关键特征，包括细胞死亡增加、活性氧（ROS）水平升高、钙信号缺陷（Ca2+）和纤维化重塑。该模型为研究疾病机制和推进药物筛选提供了强大的3D平台。
引言
杜氏肌营养不良症（DMD）是一种X连锁隐性遗传病，由编码肌营养不良蛋白的DMD基因突变引起。随着支持性护理的进步延长了患者寿命，扩张型心肌病（DCM）已成为晚期DMD患者的主要死因。然而，由于缺乏可靠的人类心脏组织模型，其确切发病机制仍不清楚。传统二维（2D）心肌细胞（CM）培养和动物模型在模拟人类心脏复杂三维（3D）病理生理方面存在局限。本研究利用患者来源hiPSCs、其同基因对照和健康hiPSC系，开发了3D心脏类器官（COs），并进一步结合生物打印技术构建了生物打印心脏类器官（bCOs），旨在建立一个能够重现DMD心肌病关键特征的体外研究平台。
结果
2.1 营养不良性心脏类器官表现出细胞死亡、氧化应激和机械刚度增加
研究人员从健康对照（HC）、同基因DMD校正（DMD-Iso）及DMD患者来源的hiPSCs中生成了心脏类器官（COs）。在心脏分化第15天，DMD-COs与对照组相比，表现出关键疾病特征：细胞死亡增加、活性氧（ROS）水平升高。活/死染色和流式细胞术分析证实，DMD-COs中死亡和凋亡的心肌细胞比例显著高于对照。此外，DMD-COs表现出更高的氧化应激水平，特别是烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶4（NOX4）的mRNA表达和活性（NADPH水平）显著上调。机械压缩测试进一步显示，DMD-COs的杨氏模量和压缩应力更高，表明其硬度增加，这与疾病进展中心脏组织被纤维组织替代导致僵硬度增加的病理特征相符。
2.2 DMD-COs中的钙处理失调
钙信号失调是DMD心肌病的另一个标志。通过钙成像分析发现，DMD-COs表现出自发性钙瞬变频率增高，以及在电刺激下的钙瞬变参数异常，包括上升和下降斜率显著增加、曲线下面积（AUC）增大。RNA测序数据分析也揭示了DMD-COs中与动作电位、钙处理和胎儿基因重新激活相关的标志物显著失调。这些发现证实了DMD-COs中存在钙处理失调，并将其与氧化应激和心肌病进展联系起来。
2.3 藻酸盐-明胶生物墨水合成与表征
为了更精确地模拟天然细胞外基质（ECM），研究开发了一种由7%海藻酸和5%明胶组成的共聚物生物墨水。流变学测量显示该生物墨水适合打印。打印后分析证实了高精度和结构保真度，表明该生物墨水适用于构建复杂的3D心脏结构。
2.4 藻酸盐-明胶水凝胶促进类器官融合并保留搏动表型
将COs封装入水凝胶中制成生物墨水并进行3D生物打印，形成了生物打印的心脏类器官结构（bCOs）。活/死染色显示，水凝胶支持长期培养，且随着时间的推移，所有细胞系的bCOs中的类器官倾向于融合，面积显著增加。尽管搏动频率的变化在统计学上不显著，但观察到健康对照和同基因对照bCOs的频率有轻微增加趋势，而营养不良性bCOs则呈现相反趋势。这表明水凝胶有效支持了类器官融合和功能维持。
2.5 bCOs的分子特征揭示健康和营养不良性结构中基因表达和蛋白质水平的时序变化
基因表达分析显示，所有细胞系的bCOs中，心肌细胞标志物基因表达随时间推移逐渐上调，而多能性标志物OCT4表达下降。在第14天，与健康对照bCOs相比，DMD-bCOs中大多数心脏结构基因（如MYH6、MYH7、ACTN2、TNNT2和NKX2.5）表达下调。免疫荧光染色显示，所有bCOs中连接蛋白43（Cx43）的定位均增加，表明细胞连接增强；而早期心脏转录因子NK2同源框5（NKX2.5）水平较低，提示成熟度增加。然而，在营养不良性bCOs中，裂解的胱天蛋白酶3（CCASP3）水平显著升高，表明其凋亡程度高于生物打印的对照组和未嵌入的类器官。
2.6 营养不良性生物打印结构中细胞外基质沉积增强
马松三色染色分析显示，在第14天，DMD-COs和DMD-bCOs中均存在显著的胶原纤维，而DMD-Iso和HC组无论是否生物打印，胶原沉积都极少或没有。BODIPY染色显示，DMD-COs中脂滴积累增加，但在DMD-bCOs中未检测到这种增加，表明生物打印环境可能影响了脂肪生成。此外，对间充质漂移（MD）特征基因的分析发现，bCOs显示出独特的表达谱。这些结果证实，营养不良性生物打印结构成功重现了DMD相关的纤维化病理变化。
讨论与结论
本研究证明了3D心脏类器官和生物打印心脏结构作为研究DMD相关心肌病相关模型的潜力。这些模型重现了关键的病理特征，包括氧化应激升高、钙处理失调、细胞凋亡和死亡增加以及纤维化。DMD-COs中观察到的NOX4上调和钙瞬变改变，突出了氧化应激、肌浆网功能障碍和细胞凋亡之间的相互作用。生物打印的微环境调节了组织组织和应激反应，在某些情况下加剧了营养不良性结构中的疾病相关表型。
当前模型的一个关键局限是对心脏组织复杂性的不完全呈现，包括缺乏心内膜和心外膜细胞层以及血管化有限。未来的研究应侧重于优化生物墨水组成、加入血管和基质细胞群以及控制氧气和机械梯度，以进一步增强病理生理相关性。
总之，标准化和生物打印的心脏类器官为DMD的比较疾病建模和临床前研究提供了互补的3D平台，弥合了简化2D模型与体内系统之间的差距，为未来的临床前研究和治疗筛选工作奠定了基础。
