针对类风湿性关节炎的生物标志物：利用硅钼酸功能化的金属有机框架去除高丰度蛋白质

血清高丰度蛋白（HAPs）选择性去除技术结合液相色谱-串联质谱分析，从类风湿关节炎（RA）患者血清中鉴定出5个新型潜在生物标志物（GAPDH, TPI1, PFN1, HSP90AA1, CALM1），其中CALM1为首次发现与RA相关的血清蛋白。

　　

王颖|吴素琴|朱青涛|孙世伟|赵玉春|郑子宇|刘云|梅希凡|胡雪|陈青

沈阳医学院基础医学科学学院药学院，中国沈阳 110034

摘要

高丰度蛋白质（HAPs）占总血清蛋白质的90%以上，选择性地去除这些蛋白质对于提高低丰度蛋白质的检测至关重要，因为低丰度蛋白质在疾病机制和潜在生物标志物的发现中起着关键作用。在类风湿性关节炎（RA）中，现有的诊断生物标志物具有有限的敏感性和特异性，这凸显了需要更准确的分子指标。本研究结合了HAPs的去除与先进的蛋白质组学分析技术，以改善血清蛋白质分析并识别与RA相关的新潜在生物标志物。通过氢键将硅钼酸（SiMo₁₂O₄₀）固定在UiO-66框架上，合成了一种聚氧金属酸盐改性的金属有机框架（POM-MOF）复合材料SiMo₁₂O₄₀@UiO-66。这种富含氧的复合材料通过静电相互作用选择性地吸附人血清白蛋白（HSA）、转铁蛋白（Trf）和免疫球蛋白G（IgG），这些蛋白质含有正电荷的赖氨酸和精氨酸残基。在优化实验条件下（pH 5.0，700 mmol·L^?1 NaCl，BR缓冲液），1.0 mg的SiMo₁₂O₄₀@UiO-66从1.0 mL浓度为100 μg·mL^?1的蛋白质溶液中分别去除了95.8%的HSA、93.5%的Trf和75.0%的IgG。吸附动力学和平衡数据分别很好地符合伪一级模型和Langmuir模型，证实了其单层吸附行为。利用液相色谱-质谱（LC-MS/MS）进行的蛋白质组学分析在未经处理的血清中检测到203种蛋白质，在去除HAPs后检测到214种蛋白质，其中包括46种新发现的低丰度蛋白质。对RA和健康血清的比较蛋白质组学分析显示有154种差异表达的蛋白质。随后的生物信息学分析突出了五种潜在生物标志物：GAPDH、TPI1、PFN1、HSP90AA1和CALM1，其中CALM1是首次被报道与RA相关，表明其具有潜在的诊断意义。

引言

类风湿性关节炎（RA）是一种慢性全身性自身免疫性疾病，主要特征是关节及其周围结缔组织的持续炎症[1]，[2]。全球约有0.5–1%的成年人患有RA[3]。尽管RA可以在任何年龄发病[4]，但40岁以后的发病率显著增加，女性患病的可能性是男性的两到三倍[5]。RA患者面临严重的感染[6]、慢性肺病[7]、[8]以及血管疾病[9]、[10]、[11]的风险增加。RA的诊断主要依据2010年美国风湿病学会/欧洲抗风湿联盟（ACR/EULAR）的分类标准，该标准综合评估了关节受累情况、血清学参数、炎症标志物和症状持续时间。然而，由于早期临床表现往往是非特异性的，诊断通常会延迟2.5年[12]，[13]。RA的早期诊断可以实现及时的治疗干预，从而减缓疾病进展、减少关节损伤并降低全身并发症，这一方面越来越受到临床关注。在诊断工具中，血清类风湿因子（RF）是一个公认的潜在生物标志物，与疾病严重程度相关，并常用于临床疑似病例的辅助诊断[14]。RF通常以识别并结合免疫球蛋白G（IgG）Fc区域的免疫球蛋白M（IgM）抗体的形式被检测到[15]。尽管在已确诊的RA患者中几乎80%可以检测到RF，但在疾病早期其敏感性有限，只有大约50%的患者在症状出现后的前六个月内检测呈阳性[16]。RF在Sj?gren综合征[17]、[18]、冷球蛋白血症[19]、[20]和系统性红斑狼疮[21]、[22]等几种自身免疫性疾病中也可能呈阳性。因此，仅凭RF不足以确诊RA。识别新的潜在生物标志物对于实现早期诊断、监测疾病进展、支持治疗开发以及加深对RA发病机制的理解至关重要。

蛋白质组学旨在系统地分析生物系统中蛋白质的表达水平、翻译后修饰和相互作用，以全面揭示生命活动的分子基础[23]，[24]。基于液相色谱-质谱技术的血清蛋白质组学可以识别疾病样本中异常表达的蛋白质，为潜在生物标志物的发现提供了可能性[25]。然而，这一领域长期以来一直面临一个关键瓶颈：体液（如血清）中蛋白质浓度的动态范围极广（通常跨越10个数量级），高丰度蛋白质在质谱分析过程中会严重掩盖低丰度蛋白质的信号，使得许多具有重要生物学功能或疾病指示意义的低丰度蛋白质难以被检测到[37]。因此，有效去除高丰度蛋白质已成为提高蛋白质组学分析深度的关键步骤。

近年来，基于功能性材料的预处理策略在解决蛋白质组学瓶颈方面显示出显著潜力。具有最佳物理化学性质的功能性复合材料能够有针对性地去除干扰物质，同时富集复杂样本（如血清）中的疾病相关蛋白质，从而促进潜在生物标志物的发现和研究。例如，Emily A Reasoner等人设计了一种原位生长的金属有机框架（MOF）来去除血清白蛋白。随后的蛋白质组学分析在处理后的样本中识别出54种以前无法检测到的蛋白质、12个药物靶点和多个潜在生物标志物[27]。Xie等人开发了一种功能性材料（5–4-甲氧基苯基)-1-苯基-1H-1,2,3-三唑（MPT），该材料能够通过特定的分子相互作用吸附白蛋白和IgG。对剩余蛋白质部分的蛋白质组学分析揭示了与宫颈癌发病机制相关的几个失调靶点[28]。

值得注意的是，另一种解决低丰度蛋白质检测挑战的重要策略是直接富集目标成分，例如分离外泌体等生物囊泡以获得富含疾病相关信息的蛋白质亚群[29]。近年来，外泌体富集技术取得了显著进展，例如使用超分子化学探针阵列进行高通量捕获和原位蛋白质分析，这可以在微小样本体积内有效获取外泌体和表面蛋白质信息，为液体活检提供了强大的工具[30]。然而，这些方法的检测很大程度上受到囊泡本身含量的限制，并且难以避免同时分离出的自由高丰度蛋白质的干扰。相比之下，旨在直接去除高丰度蛋白质的材料基策略提供了一种更根本和通用的样品简化方法。

由POM改性的金属有机框架（POM-MOF）构建的复合材料在多个领域找到了广泛应用，包括传感[31]、催化[32]、吸附[34]等。例如，Chen等人[35]开发的基于八钼酸盐的材料整合到金属有机框架MIL-101中，已被用于高效去除人血浆中的HAPs。在各种POM中，硅钼酸因其出色的化学稳定性和独特的结构特征而脱颖而出。它由通过氧桥连接的钼氧和硅氧四面体组成，形成了一个坚固的聚合物框架。这种结构提供了多个金属结合位点，使硅钼酸特别适合生物医学应用。此外，越来越多的证据表明，基于钼酸盐的化合物在多个领域展现出良好的潜力，包括抗菌活性[36]、抗氧化效果[37]、抗癌特性[38]和药物递送[39]。基于锆的金属有机框架UiO-66以其出色的结构稳定性、可调的孔隙率和广阔的比表面积而著称。UiO-66由与有机连接剂配位的锆金属节点构成，在高温和强酸或强碱等苛刻条件下仍能保持其晶体框架[40]，[41]。此外，通过控制合成参数可以精确调节UiO-66的多孔结构，提高其在吸附[42]、[43]、分离[44]、[45]和催化[46]等应用中的效果。在生物医学领域，Li等人[48]将NO-泼尼松龙封装在UiO-66-NH₂中，用白细胞介素-10（IL-10）功能化框架表面，随后用巨噬细胞膜包覆。所得的仿生纳米颗粒有效地减缓了小鼠模型中的骨关节炎进展。同样，Lanli Huang等人[49]开发了一种叶酸（FA）改性的UiO-66-NH₂-基MOF，加载了白藜芦醇，作为骨关节炎治疗的抗氧化剂和靶向巨噬细胞的纳米药物递送系统。POM和MOF已在多个学科中得到广泛探索，展现出巨大的生物医学和技术应用潜力。

在本研究中，SiMo₁₂O₄₀通过氢键成功固定在金属有机框架UiO-66的表面，形成了新的复合材料SiMo₁₂O₄₀@UiO-66。由于其有利的静电相互作用，该复合材料在吸附和去除丰富的血清蛋白质（包括HSA、Trf和IgG）方面表现出高效。这项工作介绍了一种从人血清中选择性去除HAPs的创新策略。此外，将这种去除方法与质谱和生物信息学分析相结合，实现了健康对照组和RA患者血清的全面差异蛋白质组学分析。通过这种方法，识别出五种与RA相关的潜在生物标志物：GAPDH、TPI1、PFN1、HSP90AA1和CALM1，为RA的发病机制提供了宝贵的见解，并为早期诊断和靶向治疗研究带来了新的前景。

章节片段

SiMo₁₂O₄₀@UiO-66的制备

首先使用DMF作为反应介质，通过溶剂热法制备了金属有机框架（MOF）UiO-66[50]。随后，将硅钼酸（SiMo₁₂O₄₀）固定在UiO-66表面，构建了POM-MOF复合材料。将60.0 mg的UiO-66粉末分散在30.0 mL浓度为2.0 mg·mL^?1的SiMo₁₂O₄₀水溶液中。混合物在室温下搅拌24小时。产物通过8000 rpm离心5分钟进行分离。得到的固体

SiMo₁₂O₄₀@UiO-66的特性

UiO-66是通过溶剂热法合成的[50]。简而言之，将氯化锆（ZrCl₄）和对苯二甲酸（H?BDC）溶解在N,N-二甲基甲酰胺（DMF）中，制备UiO-66的合成混合物。混合物经过控制加热后冷却至室温。所得沉淀物彻底洗涤并干燥，得到细白的UiO-66粉末。用于复合材料制备时，将UiO-66粉末分散在

结论

本研究成功合成了一种聚氧金属酸盐改性的金属有机框架复合材料（SiMo₁₂O₄₀@UiO-66），并使用FT-IR、拉曼光谱、TGA、EDS、SEM和TEM对其进行了全面表征。在pH 5.0条件下，该复合材料对高丰度血清蛋白质（包括HSA、Trf和IgG）表现出显著的吸附效率，主要是通过静电相互作用，建立了一种有效的从血清中选择性去除这些蛋白质的策略。

CRediT作者贡献声明

王颖：撰写——原始草稿，数据整理。吴素琴：软件，方法学，研究。朱青涛：监督，软件，方法学，研究。孙世伟：正式分析，数据整理。赵玉春：验证。郑子宇：数据整理。刘云：可视化。梅希凡：资金获取，概念构思。胡雪：正式分析。陈青：验证，方法学，资金获取。

伦理批准

本研究得到了中国医科大学第一附属医院医学研究伦理委员会的批准（伦理审查编号2023年第568号）。

未引用参考文献

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利益冲突声明

作者声明他们没有已知的可能会影响本文所述工作的财务利益或个人关系。

致谢

作者衷心感谢以下资助机构的财政支持：国家自然科学基金（资助编号21804093）、辽宁省科技厅的关键研发项目（资助编号2025JH2/102800051）、辽宁省科技厅的未来产业前沿技术项目（资助编号2025080219-JH2/1013）、辽宁省科技厅的项目