《Canadian Journal of Microbiology》：Mass mortalities caused by different genotypes of HPAIV H5N1 clade 2.3.4.4b in colony breeding Black-headed Gulls and Sandwich Terns in Denmark 2022 and 2023
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这篇综述文章通过分子流行病学与生态学调查，系统分析了2022–2023年间在丹麦导致白嘴端燕鸥（Sandwich Tern）与黑头鸥（Black-headed Gull）群体大量死亡（MMEs）的不同高致病性禽流感病毒（HPAIV） H5N1 clade 2.3.4.4b基因型（EA-AB与EA-BB）。研究揭示了物种间传播模式、病毒基因型转换（从EA-AB到EA-BB）与宿主适应性之间的关联，强调了新型海鸥适应型病毒（EA-BB）对群体繁殖海鸟、家禽乃至公共卫生构成的严重威胁。
摘要
2022年及2023年，欧洲多国报告了前所未有的海鸟群体大量死亡事件，这些事件被归因于Clade 2.3.4.4b H5N1高致病性禽流感病毒。在丹麦，白嘴端燕鸥与黑头鸥的种群受到了显著影响。研究记录了这两年的死亡率事件，并通过对相关病毒进行基因测序，探讨了病毒传播与宿主易感性的动态变化。
1. 引言
高致病性禽流感病毒H5分支2.3.4.4b自2014年出现后，已多次通过候鸟传播至欧洲，并在2021年后在欧洲鸟类种群中成为地方性流行。这些病毒宿主范围广泛，已在大约200种鸟类中被检测到。禽流感病毒的基因组由八个基因节段构成，其中血凝素和神经氨酸酶基因决定了病毒的亚型，而基因型则由所有八个基因节段的组合决定。在2022年和2023年，与clade 2.3.4.4b H5N1 HPAIV相关的、前所未有的群体大量死亡事件在欧洲的群体繁殖海鸟中发生。在丹麦，2022年白嘴端燕鸥的死亡率尤其显著，而黑头鸥在2023年春季则出现了大规模死亡。本研究旨在通过记录2022年和2023年繁殖群体中的死亡率，并对相关的禽流感病毒进行基因特征分析，以调查这些群体大量死亡事件的原因。
2. 材料与方法
2.1. 伦理批准
标本采集遵循所有适用法律、指南和法规，并采取了多项预防措施以尽量减少干扰。
2.2. 研究对象
黑头鸥在丹麦繁殖，通常在包括英国、荷兰和法国在内的西欧国家越冬。它们于三月至四月间返回丹麦的繁殖地。白嘴端燕鸥是一种以鱼类为食的海鸟，在非洲西海岸和南海岸越冬，于四月迁徙至丹麦。抵达繁殖地后，它们通常在黑头鸥群体内部或附近筑巢，以获得保护。这两种鸟类的繁殖周期和觅食习性存在差异，黑头鸥是机会主义的通才觅食者，而白嘴端燕鸥则专精于海洋鱼类。
2.3. 研究地点与鸟类学数据收集
研究地点覆盖了丹麦境内的多个白嘴端燕鸥和黑头鸥群体。在2022年和2023年，执行了欧盟针对包括黑头鸥和白嘴端燕鸥在内的死亡野鸟的强制性被动监测。此外，在2022年，在最大的两个白嘴端燕鸥群体（Krik Sand?和Hirsholm）针对死亡白嘴端燕鸥进行了主动监测。在2023年，主动监测仅限于Krik Sand?群体的活体成鸟、雏鸟以及繁殖期后的栖息地。通过计数巢穴或无人机拍照的方式统计了繁殖对数。研究期间对多个群体进行了探访以寻找死亡鸟类。
2.4. 病毒检测样本采集
被动监测依赖于公众、野生动物管理员、鸟类学家等对发现死亡野鸟的通知，通常选择最多三只鸟进行检测。在群体大量死亡事件期间，除选作检测的个体外，尸体均留在原地。采集的气管和泄殖腔拭子被合并，并同时采集脑部拭子。2022年6月至7月，从最大的两个白嘴端燕鸥群体中收集了新鲜死亡的成鸟，并对其中的73个个体采集了肝脏样本。2023年，从活体白嘴端燕鸥采集了口咽和泄殖腔拭子，样本来自繁殖期巢穴中的成鸟、雏鸟以及繁殖期后栖息地的成鸟。
2.5. 病毒检测与测序
对来自活体鸟类的拭子样本进行了分组筛查，并对高致病性禽流感阳性组的单个样本进行检测。所有样本均通过逆转录聚合酶链式反应进行禽流感病毒及其亚型检测。通过跨血凝素裂解位点的测序对H5进行确认和病毒致病型分型。利用Illumina MiSeq系统进行全基因组测序，并使用基于比对的迭代组装方法生成高质量的一致性序列。
2.6. 基因分型与系统发育分析
根据欧洲基因分型命名法，通过构建基因节段特异性的系统发育树对全基因组序列进行基因分型。从GISAID EpiFluTM数据库获取病毒序列，通过比对和筛选构建数据集。使用最大似然法构建基于八个病毒节段编码区串联序列的系统发育树，评估节点支持度。
3. 结果
3.1. 2022年和2023年白嘴端燕鸥与黑头鸥的死亡率记录
2022年，丹麦七个白嘴端燕鸥群体共有4747个巢对。在五个最大的群体中共发现404只死亡成鸟，并在六月下旬记录到至少3200只死亡雏鸟。2023年，丹麦繁殖的白嘴端燕鸥对数下降至3056对，较2022年减少了36%。2023年，在五个最大的群体中未记录到成燕鸥的异常死亡，但在所有被跟踪的群体中都发现了死亡雏鸟，总数至少为900只。对2023年发现的死亡雏鸟进行年龄评估，35%死于孵化后第一周，43%死于第二周，22%死于第三周。
2022年，在黑头鸥群体内部未记录到异常高死亡率，即使在那些有感染高致病性禽流感的白嘴端燕鸥共同繁殖的群体中也是如此。然而，2023年的模式发生改变，全国多个黑头鸥群体中记录到成鸟（随后也包括雏鸟）的群体大量死亡。研究记录和网络报告显示，至少14个群体（共包含约32000个繁殖对，占估计总繁殖种群90000对的大多数）发生了群体大量死亡。记录的成鸟死亡数量约为3000只，实际数字可能更高。在探访过的八个处于雏鸟阶段的群体中，还发现了大量7至20日龄的死亡雏鸟。
总结来说，2022年，白嘴端燕鸥的成鸟和雏鸟均经历了广泛死亡，但黑头鸥没有。2023年，白嘴端燕鸥成鸟未出现异常死亡，但黑头鸥的成鸟和雏鸟均遭受了广泛死亡（至少在某些群体中），同时，在黑头鸥群体内抚育的白嘴端燕鸥雏鸟也大量死亡。
3.2. 2022年和2023年丹麦白嘴端燕鸥和黑头鸥的高致病性禽流感被动监测
被动监测共检测了14只白嘴端燕鸥，其中13只检测出高致病性禽流感H5N1阳性。2022年6月，在经历群体大量死亡事件的繁殖群体（Sprog?或Krik Sand?）中收集的6只成鸟呈阳性。2023年6月，在Krik Sand?繁殖群体收集的7只死亡白嘴端燕鸥（1只成鸟和5只雏鸟）以及一只在远离最近繁殖地的Hedensted记录的成鸟中检测到高致病性禽流感H5N1。对2022年的三只白嘴端燕鸥病毒进行了全基因组测序，基因分型为clade 2.3.4.4b EA-AB基因型。
对高致病性禽流感阳性鸟类的尸检显示，除一只雏鸟外，其余均消瘦，且大部分（11/13）在内脏器官、脑部和/或颅骨观察到淤血和/或出血。
2023年，总共检测了89只黑头鸥，其中65只成鸟和11只雏鸟检测出高致病性禽流感H5N1阳性。绝大多数阳性鸟类在5月至7月期间收集。对来自10个繁殖群体的29只鸟类的病毒进行了全基因组测序，全部被基因分型为clade 2.3.4.4b EA-BB病毒。
对2023年发现的76只高致病性禽流感H5N1阳性黑头鸥进行尸检，大部分呈现消瘦，部分出现肺部等器官出血或内脏淤血。2022年检测的16只黑头鸥均为高致病性禽流感阴性。
3.3 高致病性禽流感主动监测
2022年6月，在最大的两个白嘴端燕鸥群体（Krik Sand?和Hirsholm）内部主动收集的73只死亡个体的肝脏组织中均检测到高致病性禽流感H5N1，证实了该地发生的死亡与高致病性禽流感H5N1感染相关。
2023年，在Krik Sand?繁殖群体及附近的Agger Tange繁殖后栖息地进行了主动监测。总共对135只活体白嘴端燕鸥进行了采样，在4只雏鸟中检测到高致病性禽流感H5N1，而所有成鸟的逆转录聚合酶链式反应检测均为阴性。对其中三只雏鸟的病毒进行了全基因组测序，均被基因分型为clade 2.3.4.4b EA-BB基因型。
3.4. 基因分型与系统发育分析
2022年在白嘴端燕鸥中检测到的高致病性禽流感病毒被基因分型为clade 2.3.4.4b HPAIV H5N1基因型EA-AB。2023年来自白嘴端燕鸥和黑头鸥的高致病性禽流感病毒均被基因分型为EA-BB。
对2022年白嘴端燕鸥串联全基因组序列的最大似然法系统发育分析表明，这些病毒与当时在丹麦野生鸟类中检测到的EA-AB病毒密切相关，也与来自瑞典白嘴端燕鸥和黑头鸥的病毒以及欧洲邻国不同鸟种的病毒密切相关。
对2023年在丹麦白嘴端燕鸥和黑头鸥中检测到的高致病性禽流感病毒进行的最大似然法系统发育分析显示，2023年白嘴端燕鸥中检测到的高致病性禽流感病毒与黑头鸥的高致病性禽流感序列形成了一个紧密的单系分支，并得到了较高的自举值支持，这表明它们有一个最近的共同祖先。
4. 讨论
2022年，白嘴端燕鸥的成鸟和雏鸟出现了广泛死亡，但黑头鸥没有。2023年，白嘴端燕鸥成鸟未出现异常死亡，但黑头鸥的成鸟和雏鸟以及生活在黑头鸥群体中的白嘴端燕鸥雏鸟却遭受了广泛死亡。这些死亡事件与clade 2.3.4.4b HPAIV H5N1的检测相关。2022年在白嘴端燕鸥中检测到的病毒是EA-AB基因型，而2023年在黑头鸥和白嘴端燕鸥雏鸟中检测到的病毒是EA-BB基因型。
对2022年白嘴端燕鸥高致病性禽流感H5N1病毒的系统发育分析表明，这些病毒与当时在丹麦及欧洲西北部其他国家检测到的病毒密切相关，支持了大多数燕鸥是在丹麦本地感染的观点。
白嘴端燕鸥倾向于在黑头鸥群体内部或附近繁殖。2023年，在Krik Sand?的黑头鸥和白嘴端燕鸥雏鸟中均检测到HPAIV H5N1基因型EA-BB。系统发育分析表明，燕鸥雏鸟感染的病毒与其共存的鸥类病毒相同，这支持了2023年在丹麦存在潜在的种间传播，并且黑头鸥可能作为感染源，将病毒传播给在其群体内繁殖的易感白嘴端燕鸥雏鸟。这与在意大利威尼斯泻湖观察到的模式相似。
研究发现，新孵化的白嘴端燕鸥雏鸟与较大雏鸟相比，对高致病性禽流感引起的死亡率并无明显差异，表明这些雏鸟对病毒没有免疫力。黑头鸥雏鸟中也未观察到特定年龄段存活率更高的迹象。
2022年5月至6月，当繁殖群体中的白嘴端燕鸥受到高致病性禽流感H5N1严重影响时，即使与感染的白嘴端燕鸥共存于同一群体，黑头鸥似乎也未受高致病性禽流感影响。一个可能的解释是，鸥类对感染燕鸥的EA-AB基因型病毒不那么易感。当时，EA-BB基因型尚未在丹麦出现。2022年夏季，EA-BB主要在法国、比利时、荷兰和英国的银鸥中被检测到。随后，EA-BB可能随着黑头鸥从西欧越冬地返回而向北传播至丹麦。EA-BB基因型含有多个来自鸥类的基因节段，因此可能比广泛感染雁形目鸟类且不含鸥类基因节段的EA-AB基因型病毒更能适应鸥类。当这种适应鸥类的EA-BB病毒在2023年5月至6月传播至丹麦的繁殖群体时，导致了鸥类的群体大量死亡，并蔓延至与之共存的、无免疫力的白嘴端燕鸥雏鸟，造成其大量死亡。在黑头鸥中，成鸟繁殖个体的死亡比例在许多西北欧国家都很可观。
近期一项研究在白嘴端燕鸥中检测到了抗体，表明2022年高致病性禽流感H5N1 clade 2.3.4.4b爆发后可能产生了保护作用。虽然这种保护作用的水平和持续时间尚不清楚，但2023年成体白嘴端燕鸥未受严重影响，可能归因于2022年感染EA-AB病毒后产生的保护性免疫。其他因素也可能起作用，例如最易感的个体已在2022年的高致病性禽流感疫情中被淘汰。
在2022年和2023年丹麦黑头鸥和白嘴端燕鸥繁殖群体的群体大量死亡事件期间，仅收集了用于禽流感病毒检测的死亡鸟类，其余尸体留在群体中。在疫情早期移除尸体可能保护健康个体免受感染，但频繁的人类活动会干扰繁殖鸟类，可能影响繁殖成功率，甚至可能导致受感染鸟类飞往其他群体而进一步传播病毒。高致病性禽流感病毒可在粪便、尸体以及淡水环境中（尤其在低温下）长时间保持感染性，这使得水生栖息地成为传播的关键储存库。此外，尸体处理可能涉及长距离运输，有进一步传播病毒的风险。高致病性禽流感是一种人畜共患病，需要采取预防措施保护进入群体和处理尸体的人员免受病毒暴露。
虽然EA-BB病毒主要在鸥类中被检测到，但该病毒曾于2023年7月在丹麦一个拥有60只散养鸡的小型家禽农场引发高死亡率的高致病性禽流感疫情。该病毒的序列与当时丹麦黑头鸥的病毒序列高度相似。鸥类容易被家禽养殖场吸引，因此可能构成将高致病性禽流感病毒（即使是适应鸥类的病毒）引入农场的风险。同样，在鸥类中大规模检测到该基因型的时期，捷克共和国也确认了EA-BB基因型在商业火鸡中爆发。EA-BB基因型还与哺乳动物中的疫情有关，例如2022年10月西班牙的水貂和2023年7月芬兰的毛皮农场，其病毒来源很可能是鸥类。这表明，来自群体水鸟和海鸟的高致病性禽流感病毒不仅对这些群体鸟类的保护构成威胁，也对家禽养殖和公共卫生构成了威胁。
