《Advanced Science》：Single-Cell Atlas of Subchondral Bone Marrow Lesions Reveals Proteostasis Dysfunction as a Druggable Mechanism for Early Osteoarthritis
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本研究通过构建骨关节炎早期特征性骨下骨髓病变（BMLs）的小鼠模型，结合单细胞测序与谱系示踪技术，首次系统揭示了BMLs形成的细胞与分子机制。研究发现在骨关节炎状态下，软骨下骨成骨细胞热休克蛋白70（HSP70）表达下调与去泛素化酶19（USP19）失调，共同导致蛋白稳态失衡，引发胶原蛋白错误折叠并通过USP19介导异常分泌至细胞外基质，驱动BMLs中异常骨基质的病理性积累。同时，成骨细胞分泌的WNT5A与肥厚性软骨细胞（HTCs）相互作用，加速其肥厚与凋亡，加剧软骨退变。实验证实，药物性诱导HSP70表达可抑制异常骨基质形成并缓解骨关节炎进展。孟德尔随机化分析进一步支持了蛋白酶体功能障碍与人类骨关节炎风险的显著关联。这些发现为早期骨关节炎的干预提供了新的治疗靶点和理论依据。
1 引言
骨关节炎（OA）是全球范围内最常见的慢性退行性疾病，影响着全球约5.9亿人，是导致残疾的主要原因。然而，目前尚无有效策略能在早期可逆损伤阶段阻止其进展。近年来，有证据表明软骨下骨病变可能早于并触发软骨损伤，其中骨下骨髓病变（BMLs）是软骨下骨中一种新兴的影像学生物标志物，在磁共振成像（MRI）的T2加权脂肪抑制序列上可被检测。它被认为是异常机械应力诱导的骨基质微损伤区域，具有动态变化特征。组织病理学上可观察到骨小梁增厚、血管增生、纤维化和脂肪细胞浸润。临床上，BMLs与关节疼痛、软骨缺损及关节置换风险密切相关，并已成为OA的早期影像生物标志物，常在影像学软骨缺失之前出现，并能预测结构进展和症状严重程度。尽管如此，BMLs的早期病理表型、发病机制及其在驱动OA结构恶化中的作用仍未得到充分阐明。
此前的研究已对OA晚期骨和软骨进行了单细胞RNA测序（scRNA-seq）分析，揭示了软骨细胞群体的异质性特征，并发现肥厚性软骨细胞（HTCs）与OA显著相关，但尚未阐明触发软骨细胞肥大的具体机制。此外，目前的单细胞研究主要聚焦于分离的软骨或骨组织，未能解析完整骨软骨单元内，尤其是在BMLs发展过程中的骨-软骨相互作用机制。因此，构建BMLs时期的复合骨软骨单细胞图谱对于阐明BMLs发展机制及骨-软骨相互作用至关重要。
本研究创新性地建立了模拟人类BMLs的标准化小鼠模型，并利用MRI动态表征了其与软骨退变显著相关的特性，同时揭示了BMLs区域内显著的异常骨基质积累。通过构建小鼠膝关节在BMLs发展过程中的骨软骨单细胞图谱，发现了骨关节炎软骨下骨成骨细胞中热休克蛋白70（HSP70）和去泛素化酶19（USP19）表达失调驱动的蛋白酶体功能障碍和错误折叠胶原异常分泌，是BMLs形成的关键机制。此外，细胞间通讯分析和Col10a1-Cre; R26tdt+谱系示踪分析揭示，成骨细胞分泌的WNT5A介导了与肥厚性软骨细胞的互作，加速了其肥大和死亡。重要的是，通过TRC051384药物靶向HSP70可抑制胶原错误折叠/分泌，预防BMLs形成。孟德尔随机化结果进一步证明了蛋白酶体基因表达与人类OA风险之间的显著相关性，为蛋白酶体功能障碍在BMLs发病机制中的潜在作用提供了支持。这些数据共同揭示了BMLs形成的机制，并为早期OA干预提供了治疗靶点。
2 结果
2.1 在小鼠术后跑轮运动模型中模拟人类BMLs的发生与进展
如图1A所示，研究者评估了一名57岁女性右膝的4年系列MRI扫描数据。发现BMLs面积的进展先于关节面软骨缺损的进展（图1B），即在基线至2年随访期间，BMLs大小从0增加到1，随后在2年至4年随访期间，关节面软骨缺损从0增加到2。为验证这一发现，研究团队着手在小鼠中建立术后跑轮运动模型以模拟人类BMLs的发生和进展（图1C）。建模后一周，任何组均未在MRI上检测到BMLs迹象（图1D）。值得注意的是，在前交叉韧带横断联合跑轮运动（A+R）组中，建模后两周的T2加权MRI脂肪抑制序列上显示出高信号的BMLs病变，相应的HE切片显示BMLs区域内存在异常的骨基质积累（图1D）。此外，在非病变区域出现了异常的脂肪细胞积累，这通过苏丹III染色得到证实。建模后四周，A+R组的MRI显示弥漫性多灶性BMLs，而组织学显示软骨下异常骨基质积累（图1D），与影像特征在空间上具有一致性。关键的是，随着BMLs的发展，软骨损伤进一步加剧（图1E），提示BMLs与软骨退变之间存在相关性。
为了动态分析小鼠BMLs模型，研究者在建模后1、2、4周对骨和软骨进行了多方面评估。建模一周后，与对照组相比，A+R组表现出骨小梁密度降低，同时TRAP+破骨细胞数量增加，表明骨重塑启动。此外，成骨标志物SP7和作为次级骨化中心血管亚型S型血管标志物CD31/Ly6a的表达轻度上调。然而，软骨并未表现出基质降解、软骨细胞凋亡和结构损伤，提示该模型在1周时处于早期OA阶段。建模两周后，A+R组骨小梁密度显著增加，而TRAP+破骨细胞数量继续增加。同时，SP7表达和血管密度显著增加，表明骨重塑平衡向骨合成代谢转变。在软骨中，COLII表达降低，MMP13和TUNEL表达增加，但软骨尚未出现明显的结构性损伤，提示此阶段仍处于OA的早期可逆阶段。建模四周后，A+R组出现板层状骨小梁和骨赘。值得注意的是，TRAP+破骨细胞减少，而SP7和血管分布上调，表明以成骨为主导的重塑驱动了硬化。此外，钙黄绿素双标记显示BMLs组骨形成增强，表现为骨小梁矿物沉积率（MAR）、矿化表面/骨表面（MS/BS）和骨形成率/骨表面（BFR/BS）增加。软骨显示出明显损伤，并伴有软骨细胞凋亡增加。基于对A+R模型的多方面验证，研究者构建了这些变化的动态图谱，为研究BMLs的发病机制提供了参考标准。
2.2 单细胞RNA测序揭示BMLs中蛋白质折叠缺陷和异常的骨软骨相互作用
为了在单细胞分辨率下研究术后跑轮运动诱导的小鼠BMLs，研究者对后肢胫骨平台和股骨髁进行了scRNA-seq分析（图2A）。从BMLs组和对照组共获得14,291个细胞，经过严格过滤后保留了13,446个细胞。随后分离骨软骨细胞谱系进行后续分析，这些细胞通过先前报道的标志物被定义为12个不同的细胞簇。软骨谱系群体包含7个亚群：增殖性软骨细胞、Ucma阳性软骨细胞、Chil1阳性软骨细胞、肥厚性软骨细胞、Cytl1阳性调节细胞、前肥大软骨细胞和纤维软骨细胞。伪时间轨迹分析结果表明，Chil1+、增殖性软骨细胞和Ucma阳性软骨细胞作为起点，经过中间的Cytl1阳性调节细胞，最终分化为晚期的前肥大软骨细胞、肥厚性软骨细胞和纤维软骨细胞。骨谱系群体包括表达Sp7, Bglap2和Postn的成骨细胞，以及表达Dmp1和Col1a1的成熟骨细胞。两个CXC趋化因子配体12丰富的网状细胞亚型充当“细胞因子库”，其中脂肪-CAR细胞表达Lepr, Lpl和Cxcl12，而成骨-CAR细胞共享Cxcl12但独特表达神经调节因子Satb2和Slit2。
为了阐明BMLs的病理机制及其对上覆软骨的影响，研究者比较了BMLs组与对照组之间骨细胞群体、软骨细胞群体以及骨软骨相互作用的差异。组间骨细胞数量未见显著变化。然而，对BMLs组与对照组骨细胞差异表达基因的富集分析表明，BMLs建模显著上调了与胶原组装和细胞外基质组织相关的基因，而显著下调了与蛋白质折叠和稳定相关的基因，提示BMLs中存在蛋白质稳态紊乱和潜在的蛋白质错误折叠。同时，京都基因与基因组百科全书富集结果与基因本体论分析结果一致，显示胶原合成基因和成骨相关的TGF-β和WNT通路基因显著上调，而与蛋白酶体功能相关的基因则显著下调。在软骨方面，BMLs组中肥厚性软骨细胞、前肥大软骨细胞和纤维软骨细胞的比例增加，其中肥厚性软骨细胞的扩增最为显著。来自BMLs组的整个软骨细胞群体富集了与凋亡信号通路相关的基因，而与蛋白质翻译和RNA剪接相关的基因则下调。值得注意的是，肥厚性软骨细胞亚群也表现出凋亡基因表达的显著富集，表明其死亡增加。细胞间通讯分析结果表明，当成骨细胞作为唯一的配体发送者时，BMLs组中成骨细胞与肥厚性软骨细胞之间的相互作用强度增加最为明显，意味着成骨细胞可能主要通过影响肥厚性软骨细胞来影响上覆软骨。至关重要的是，研究者发现成骨细胞和肥厚性软骨细胞通过WNT5A-FZD4/5-LRP5配体-受体对进行通讯，提示骨来源的WNT5A是BMLs发展过程中介导骨软骨相互作用的核心信号分子。综上所述，这些发现表明BMLs的形成可能与软骨下骨细胞的蛋白质稳态和蛋白质折叠紊乱有关，并且骨细胞来源的WNT5A可能介导了软骨细胞肥大和死亡的增加。
2.3 HSP70缺乏通过引起错误折叠胶原的细胞外积累驱动BMLs形成
为了进一步研究BMLs的发病机制，研究者分析了BMLs组与对照组骨细胞的差异表达基因，并鉴定出744个显著下调基因和367个显著上调基因。下调基因主要富集在热休克蛋白家族和蛋白酶体功能相关基因，而Hspa1a、Hspa1b和Hspa8参与错误折叠蛋白质的修复，并具有抗凋亡和细胞保护功能，表明HSP70缺乏可能导致与蛋白质错误折叠相关的病理；上调基因则与胶原形成以及成骨/血管生成相关。为验证HSP70的作用，免疫荧光染色显示BMLs组骨细胞中HSP70表达显著降低，而HSP70诱导剂TRC051384有效恢复了其表达并降低了I型胶原的表达。同时，研究也验证了BMLs组中HSP90的表达显著降低，这与HSP70的表达一致。天狼星红染色和透射电子显微镜共同证明了BMLs组中胶原纤维排列紊乱且I型胶原比例升高，而治疗组和对照组则表现出规则的纤维结构。此外，蛋白质印迹结果表明，TGFβ-Smad2/3通路的激活可能加速了病理性I型胶原的积累。进一步地，研究者验证了BMLs样本中WNT5A在骨细胞中显著上调，并在TRC051384干预后下降，提示HSP70减少可能通过促进骨细胞分泌WNT5A来影响肥厚性软骨细胞。考虑到BMLs区域的骨基质积累在MRI上表现为高信号，拉曼光谱图证实了早期BMLs区域中羟基和羟基磷灰石水平增加，提示异常骨基质的积累。有趣的是，鉴于BMLs与疼痛已建立的临床关联，研究者进一步评估了BMLs区域降钙素基因相关肽的表达。与对照组相比，BMLs组CGRP阳性神经纤维密度显著升高，而TRC051384干预显著降低了CGRP表达。
错误折叠蛋白质的积累可引发内质网应激，最终启动细胞凋亡。与此一致，研究者在BMLs组发现了内质网应激标志物ATF6、XBP1和CHOP的表达显著升高。胶原杂交肽是一种特异性靶向错误折叠或未折叠胶原分子的探针，结果显示其与内质网示踪剂高度共定位，提示错误折叠蛋白质在内质网内积累。此外，先前研究报道，当蛋白酶体功能受损时，去泛素化酶USP19介导错误折叠蛋白质分泌到细胞外空间，而USP19缺陷细胞缺乏此能力。受此启发，研究者发现BMLs组骨细胞中蛋白酶体标志物PSMA6、PSMB1和PSMB5显著降低，同时USP19表达上调，而TRC051384干预恢复了蛋白酶体基因的表达，提示在蛋白酶体缺乏时USP19可能介导了错误折叠蛋白质的分泌。为了阐明USP19的功能，研究者在体内使用了腺相关病毒血清型9载体敲低USP19。结果显示，USP19敲低后细胞外I型胶原积累减少，但细胞凋亡显著增加。此外，蛋白质印迹验证了BMLs组骨细胞中富集的促凋亡通路Ras-ERK-c-Fos通路关键分子的表达升高，这也可被TRC051384干预所抑制，意味着骨细胞的凋亡可能归因于激活的Ras-ERK-c-Fos通路。总之，这些发现表明HSP70减少导致错误折叠I型胶原积累，而USP19介导错误折叠蛋白质分泌到细胞外基质，最终驱动BMLs内的基质积累。
2.4 骨源性WNT5A在BMLs进展中促进肥厚性软骨细胞的扩增和凋亡
加速的软骨细胞肥大是OA进展的标志，其特征是蛋白酶分泌降解软骨基质并促进组织退化。为了验证BMLs样本中肥厚性软骨细胞数量的增加，研究者使用了遗传性Col10a1-Cre小鼠系来动态观察BMLs发展过程中的肥厚性软骨细胞。结果显示，对照组Col10a1-Cre; R26tdt+小鼠中肥厚性软骨细胞较少，但随着BMLs进展，其数量显著增加。TUNEL染色进一步显示，肥厚性软骨细胞的凋亡显著升高，同时软骨下骨板骨细胞的凋亡也同步加剧。
单细胞测序数据提示WNT5A是促进软骨细胞肥大的核心因子。作为非经典Wnt信号通路的主要分泌蛋白，WNT5A不仅参与非经典Ca2+通路，还能激活经典通路中的β-连环蛋白，从而加速软骨退化。为验证WNT5A在促进软骨细胞肥大中的作用，研究者检测了Col10a1-Cre; R26tdt+小鼠骨细胞中WNT5A的表达。与对照组相比，BMLs组骨细胞中WNT5A显著上调。值得注意的是，β-连环蛋白在肥厚性软骨细胞中表现出表达升高和核转位，其激活驱动软骨基质降解和肥大，这与研究者的发现一致。此外，给予WNT5A抑制剂BOX5有效阻止了软骨退化。总之，这些数据证明WNT5A是BMLs进展过程中软骨细胞肥大的关键驱动因子。
2.5 HSP70诱导剂TRC051384通过抑制BMLs形成改善骨关节炎
研究结果显示，HSP70诱导剂TRC051384逆转了I型胶原的错误折叠和分泌，表明其在缓解OA进展方面具有潜在功效。为了评估TRC051384对OA的治疗效果，研究者在小鼠关节腔内给予该药物。显微计算机断层扫描评估显示，A+R组软骨下骨出现板层状结构增加，提示骨硬化，而TRC051384改善了这种状况。同时，MRI显示A+R小鼠出现BMLs，但在治疗组中显著减少。组织学分析表明，治疗显著延缓了软骨基质丢失和骨硬化。同样，COLII和MMP13的免疫染色表明，OA过程中基质合成减少和分解代谢活性升高，均被TRC051384干预所抵消。胶原杂交肽染色显示，TRC051384阻止了错误折叠胶原的细胞外积累。总之，这些数据证明了TRC051384在减轻OA病理方面的显著功效。
2.6 蛋白酶体基因表达影响骨关节炎发展风险并在骨关节炎软骨下骨中下降
由于蛋白酶体功能障碍导致错误折叠胶原的异常分泌，研究者首先通过分析人类全基因组关联研究荟萃分析数据来评估蛋白酶体相关基因的表达是否会影响OA风险和发展。结果显示，PSMB8基因区域内的变异与多种OA表型表现出全基因组水平的显著关联。此外，在多个蛋白酶体基因PSMA6、PSMB1、PSMB2和PSMC6位点附近也观察到提示性关联。孟德尔随机化分析表明，全血组织中PSMB8、PSMA6和PSMC6表达水平的遗传预测升高与OA风险降低相关。受这些发现启发，研究者进一步验证了小鼠和人类软骨下骨中PSMB8和PSMA6的表达。免疫染色结果显示，在BMLs小鼠中，这两个基因的表达水平在建模后一周开始下降，并随着建模时间的延长持续降低。同时，对通过组织学评分识别的完整软骨区域和受损软骨区域对应的软骨下骨样本分析显示，与完整区域相比，受损软骨区域下方的软骨下骨中PSMB8和PSMA6的表达水平显著降低。总之，这些发现建立了蛋白酶体基因表达下降（表明蛋白酶体功能受损）与OA风险和发展之间的联系。
3 讨论
在本研究中，研究者建立了一个稳定的小鼠BMLs模型，并采用单细胞RNA测序结合遗传谱系示踪技术，解析了早期BMLs先前未知的病理表型和发病机制。研究者提出，骨细胞中HSP70表达减少导致的I型胶原错误折叠和USP19介导的细胞外分泌机制是导致BMLs内病理性骨基质积累的关键因素。同时，利用Col10a1-Cre; R26tdt+示踪小鼠，研究者发现肥厚性软骨细胞先顺序增加随后发生凋亡，并且还发现骨源性WNT5A是软骨细胞肥大的主要驱动因素。关节腔内给予HSP70诱导剂TRC051384有效减轻了BMLs的形成。这些发现加深了我们的理解，并为早期BMLs的发病机制提供了新的见解和治疗靶点。
近年来，骨关节炎的干预策略逐渐从“缓解症状”转向“早期干预”，这需要对骨关节炎各阶段的病理特征，特别是可逆损伤阶段的病理特征有透彻的了解。软骨下骨损伤先于软骨退化，可能是由于与软骨细胞相比，骨谱系细胞对机械力的敏感性更高。从宏观层面的沃尔夫定律原理到细胞层面的机械感受效率，骨谱系细胞能够迅速响应应力变化并启动重塑过程，而软骨细胞受其缓冲基质和低代谢状态的限制，对机械刺激的反应可能相对延迟。然而，当前临床领域面临双重瓶颈：缺乏敏感的早期诊断生物标志物和有效干预措施，这导致大多数患者在寻求治疗时已处于不可逆的晚期，最终需要进行关节置换。在现有成像技术中，X射线/计算机断层扫描仅限于检测晚期结构性病变，而磁共振成像可以在早期识别BMLs；然而早期BMLs的临床意义仍未得到充分认识，当前治疗仍依赖非甾体抗炎药进行症状缓解。同样，BMLs相关的基础研究受到缺乏早期人体样本和有效动物模型的限制。先前报道的动物模型存在一些局限性，包括病变发生随机、时间窗不规则和发生率低。前交叉韧带横断模型因其精确模拟关节机械性对线不良、诱导异常负荷分布和剪切力而被认为是理想的OA模型。然而，在初步研究中，单独进行前交叉韧带横断手术未能稳定诱导BMLs表型。一个关键的制约因素是术后小鼠活动量锐减，导致异常应力刺激不足。引入强制运动的突破在于，受控的强制跑轮运动不仅稳定诱导了BMLs的发生，而且显示出与运动持续时间相关的扩散性扩大。值得注意的是，在本研究使用的OA小鼠模型中，BMLs特异地发生在胫骨平台。可能的解释之一是与四足运动相关的负荷分布以及小鼠膝关节独特的解剖角度共同将异常的机械应力集中在更直接承重的胫骨软骨下骨上。基于此，研究者开发了一种协同建模策略，将前交叉韧带横断手术与受控强制跑轮运动相结合，成功建立了稳定的早期BMLs动物模型。我们的模型在早期BMLs病理表型、机制和干预方面提供了关键的参考价值：确立早期BMLs病理表型的精确表征，并定义研究基线；阐明BMLs驱动OA进展的核心机制；为在BMLs启动窗口实施精确干预以预防OA进展提供关键的理论基础。
单细胞测序显示两组之间骨细胞亚群的类型或数量没有显著差异，这使研究者推测BMLs组存在骨细胞功能障碍。进一步的研究表明，OA骨细胞的热休克蛋白家族活性和蛋白质折叠能力显著受损，主要是HSP70家族。除了其在蛋白质折叠中的公认作用外，HSP70还通过抑制凋亡信号通路和调节自噬过程发挥广泛的细胞保护作用，这些是HSP70潜在的下游机制。关键的是，蛋白质折叠依赖分子伴侣的引导以防止错误构象，其保真度受到化学微环境和机械应力的精确调控。当异常应力破坏折叠拓扑和能量景观时，会触发错误折叠蛋白质聚集，继而诱导内质网应激和蛋白质功能丧失。在生理条件下，大约30%的新生蛋白质因翻译错误、序列异常或修饰缺陷而形成错误折叠构象。细胞可以通过分子伴侣重折叠和蛋白酶体降解来维持稳态。一旦稳态被破坏，特别是当HSP70功能障碍导致其保护机制失效时，不仅会导致蛋白质折叠异常，还会损害应激适应并加速细胞稳态的系统性崩溃。本研究和先前的工作共同表明，靶向HSP70是恢复细胞稳态并干预相关疾病过程的有效策略。本研究在BMLs区域的骨细胞中同时发现了蛋白质折叠功能和蛋白酶体功能障碍的丧失。这种双重损害不仅促进了过量的错误折叠蛋白质积累，还阻碍了它们通过蛋白酶体途径的清除。最终，积累的错误折叠蛋白质经历USP19介导的细胞外分泌，沉积在细胞外基质内，直接驱动了以错误折叠诱导的病理性骨基质积累为特征的蛋白质病。USP19介导的错误折叠蛋白质分泌代表了蛋白毒性应激下一种暂时的生存策略，暂时缓解了细胞内负担并延迟了凋亡。然而，这些蛋白质的细胞外积累促进了持久聚集体的形成，破坏了骨基质完整性并加剧了慢性炎症。因此，虽然USP19活性支持了细胞的即时存活，但它无意中将蛋白质稳态危机从细胞内转移到了细胞外，从而驱动了BMLs的形成。这种双重作用阐明了补偿性的细胞反应如何演变成慢性组织变性的关键驱动因素。
软骨下骨和软骨共同构成了适应负荷传递的骨软骨单元。尽管早期病理变化可能针对单一组织，但密切的生物学和物理相互作用最终会影响整个单元。在本研究中，骨软骨相互作用显示，骨细胞中的WNT5A配体与肥厚性软骨细胞中的FZD4/5-LRP5受体关联最强，肥厚性软骨细胞数量增加了24倍，这意味着骨源性WNT5A可能促进软骨细胞肥大。WNT5A是非经典Wnt通路的核心配体，在胚胎发育过程中通过促进软骨细胞分化同时抑制其成熟来调节软骨形成；并且其表达在OA组织中显著升高。作为一种分泌蛋白，WNT5A通过ROR2/FZD受体激活经典和非经典通路，具体通过Ca2+/钙调蛋白依赖性蛋白激酶II-RUNX2轴和β-连环蛋白核转位。这种双重激活协同上调COLX和MMP13的表达，从而加速软骨基质降解并诱导软骨细胞肥大。鉴于软骨细胞肥大是OA进展的标志，本研究采用Col10a1-Cre; R26tdt+小鼠首次实现了骨源性WNT5A驱动的软骨细胞肥大的可视化，为骨软骨相互作用和肥厚过程提供了直接证据。同时，研究者发现OA进展中肥厚性软骨细胞的顺序增加主要倾向于凋亡，揭示了OA中肥厚性软骨细胞的最终命运。然而，WNT5A的分泌与HSP70功能障碍之间的机制联系有待未来研究。尽管如此，研究者的数据显示抑制骨谱系细胞中的HSP70会显著增加WNT5A的分泌，提示WNT5A的分泌是HSP70依赖性的。一致地，已有报道称HSP70缺乏可能诱导氧化应激激活AP-1/NF-κB，从而上调WNT5A转录；此外，它可能触发内质网应激和未折叠蛋白反应，导致XBP1s介导的WNT5A上调。
本研究核心的转化意义在于首次使用TRC051384作为药理学工具，验证了“靶向增强HSP70功能”策略在逆转BMLs表型方面的可行性。TRC051384是一种小分子HSP70激活剂，此前主要关注于神经系统疾病，其保护作用与HSP70介导的蛋白质质量控制机制密切相关。从分子机制角度看，其作用可能涉及特异性激活HSF1转录活性，从而提升蛋白质折叠、修复和降解网络的整体效率。本研究将TRC051384应用于骨骼系统疾病模型，不仅扩展了其潜在的临床应用场景，还在机制上确认了HSP70在维持骨谱系细胞蛋白质稳态中的关键作用。TRC051384的多效性在复杂病理环境中可能表现出双重特性：一方面，其对其他保护性应激通路的非特异性调节可能产生协同效应，增强整体细胞保护作用，这可能部分解释了其在BMLs模型中的显著功效；另一方面，这种广泛的活性也可能带来脱靶风险，这是未来治疗开发中需要优化的领域。
本研究存在一些局限性。首先，虽然建立的小鼠A+R模型成功再现了BMLs病理，但由于分辨率限制，未来需要在兔子或猪等大型动物中进行验证。其次，尽管HSP70过表达能有效预防早期OA进展，但HSP70表达减少与异常机械应力之间的精确调控机制仍需进一步阐明。最后，早期人类OA临床样本的获取仍然有限。总体而言，本研究成功建立了BMLs小鼠模型并构建了完整的单细胞RNA测序图谱，揭示了BMLs形成的机制，不仅填补了早期OA中BMLs的研究空白，也为早期OA的诊断和干预提供了治疗靶点。
