《Advanced Science》：Single-Cell RNA Sequencing of Human Lung Tissues Reveals Metallothionein-Positive T Cells as a Novel Potential Marker of Susceptibility to Chronic Obstructive Pulmonary Disease
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这篇研究通过单细胞RNA测序技术，在健康非吸烟者、pre-COPD（慢性阻塞性肺疾病前驱期）及COPD患者的肺组织中，发现了一类高表达金属硫蛋白基因的T细胞亚群（MT-high T细胞）。该细胞在疾病进展中逐渐耗竭，且其外周血频率可预测COPD风险。功能分析表明MT-high T细胞通过MIF信号抑制CD8+T细胞毒性，发挥免疫调节作用。这些发现为COPD的早期识别提供了新型生物标志物和潜在治疗靶点。
引言
慢性阻塞性肺疾病（COPD）是一种高异质性疾病，其发病机制复杂，在全球范围内是导致发病和死亡的主要原因之一。目前COPD的诊断主要依赖肺功能检查，即第一秒用力呼气容积（FEV1）与用力肺活量（FVC）比值低于0.7。然而，这种基于肺功能的标准存在明显局限性，尤其是在疾病早期，患者可能已有呼吸道症状和小气道功能障碍（SAD），但尚未出现可测量的气流阻塞，导致诊断延误。因此，识别高危人群并实施早期预防策略对于减轻疾病负担至关重要。
近年来，单细胞RNA测序（scRNA-seq）技术的发展极大地增强了对呼吸系统疾病分子基础的理解。该技术能够以单细胞分辨率探索组织内的细胞多样性，为研究COPD等复杂疾病的细胞异质性提供了强大工具。本研究利用scRNA-seq对健康非吸烟者、pre-COPD患者和稳定期COPD患者的肺组织进行分析，旨在描绘COPD进展过程中的细胞图谱，并重点关注气道免疫细胞的转录谱，以阐明疾病早期免疫景观的改变。
结果
2.1 COPD患者与对照捐赠者的肺细胞图谱
研究对4名肺功能正常的非吸烟对照者、5名pre-COPD患者和5名稳定期COPD患者的肺组织样本进行了scRNA-seq分析。经过质量控制和双重体去除后，共保留了128,536个细胞（对照组40,834个，pre-COPD组47,802个，COPD组39,900个）。通过均匀流形近似与投影（UMAP）进行降维和聚类分析，鉴定出26个不同的细胞簇，并根据经典标记基因的表达进行注释。分析发现，T细胞是主要的免疫细胞类型，其相对丰度从对照组到稳定期COPD组呈下降趋势（平均从38.47%降至27.12%）。
2.2 MT-high T细胞的发现及其在COPD进展中的动态变化
研究进一步对T细胞进行了详细的亚群分析，鉴定了7个不同的T细胞簇，包括效应CD4+T、效应记忆CD4+T、中央记忆CD4+T、耗竭CD4+T、效应CD8+T和增殖T细胞。值得注意的是，在pre-COPD患者中，效应CD4+T、效应记忆CD4+T、中央记忆CD4+T和效应CD8+T细胞的比例有增加趋势。
分析中一个引人注目的发现是鉴定出了一个先前未被描述的双阴性T细胞（DNT，即CD3+CD4?CD8?）亚群。通过差异表达基因分析发现，该亚群显著富集金属硫蛋白相关基因，包括MT1X、MT1E、MT1F和MT2A。金属硫蛋白是细胞内锌稳态的调节因子，MT1通常在成纤维细胞、上皮细胞和内皮细胞中表达，作为细胞质中的重金属解毒剂；而MT2A主要在细胞核和细胞质中表达，参与细胞增殖和凋亡等过程。据我们所知，具有高金属硫蛋白表达的T细胞亚群此前未被描述过，因此我们将其命名为“MT-high T细胞”。
通过免疫荧光染色验证了MT-high T细胞在对照受试者肺组织切片中的存在，CD3（T细胞标记物）和MT2A的共定位证实了这些细胞的原位存在。有趣的是，我们发现与对照受试者（25.20%）相比，pre-COPD（4.52%）和稳定期COPD（1.16%）患者中的MT-high T细胞显著减少，并随着疾病进展呈进行性下降。考虑到COPD中的气道损伤被认为至少部分是由CD4+、Th1效应和细胞毒性CD8+T细胞介导的，我们认为MT-high T细胞很可能在肺微环境中作为负向免疫调节因子发挥作用。这些细胞在疾病进展过程中的丢失可能导致COPD中的免疫失调，使其成为疾病状态和进展的潜在生物标志物。
2.3 MT-high T细胞缺陷作为COPD易感性的标志物
上述发现表明，与肺功能正常的非吸烟对照者相比，从pre-COPD进展到COPD的患者气道中MT-high T细胞百分比逐渐下降，这与“这些细胞的缺陷易导致pre-COPD和COPD发生”的假说一致，并推断这种缺陷可作为疾病易感性的诊断指标。
为了验证这一假说，我们首先确认了这些细胞可以在外周血中被识别。从三名健康受试者收集外周血单个核细胞，通过流式细胞术能够清晰地鉴定出表达高水平MT2A的CD45+CD3+T细胞群体。随后，我们测量了进一步患者队列中外周血MT-high T细胞的百分比。流式细胞术分析显示，在健康对照和非吸烟者中MT-high T细胞群体稳定存在，而在pre-COPD和COPD组中该群体显著减少或缺失。统计分析显示，与健康对照（8.56%，10.69%）和吸烟者（7.54%，8.48%）相比，pre-COPD（2.45%，2.50%）和COPD（1.36%，1.65%）患者中CD3+MT-high T细胞和DNT-MT-high T细胞的平均百分比显著降低。
为了严格评估MT-high T细胞的生物标志物潜力，我们进行了受试者工作特征曲线分析。结果表明，MT-high T细胞频率对肺功能下降和COPD诊断均表现出优异的预测能力（AUC分别为0.89和0.985），这为“低频率MT-high T细胞是疾病存在和进展风险的有力指标”提供了强有力的统计学证据。
对COPD患者外周血的流式细胞术分析还揭示了MT-high T细胞在pre-COPD和疾病更晚期阶段的显著耗竭。既往研究表明MT2A是一种有效的抗氧化剂，其清除活性氧的能力比谷胱甘肽强340多倍。基于此，我们推测COPD患者中观察到的MT-high T细胞下降可能至少部分归因于ROS积累超过了这些细胞的抗氧化能力，导致其凋亡。为验证这一假设，我们评估了同一队列中外周血T细胞的ROS水平。分析显示，与健康对照和吸烟者组相比，pre-COPD和更晚期COPD患者的T细胞中ROS表达显著增加，表明COPD进展过程中ROS的进行性积累确实通过氧化应激诱导的凋亡导致了MT-high T细胞的耗竭。
2.4 MT-high T细胞是具有负向调节功能的新型DNT细胞亚群
在确定了MT-high T细胞作为COPD潜在发展的早期标志物的潜力后，我们接下来探索了它们在疾病进展中的功能作用。我们对MT-high T细胞中的差异表达基因进行了功能富集分析。基因本体富集分析显示，MT-high T细胞中参与蛋白质折叠、无机化合物解毒和金属离子应激反应的基因表达升高，这与金属硫蛋白的生理作用一致。此外，T细胞激活通路也被富集，表明MT-high T细胞处于激活状态。相反，表达下调的差异表达基因主要与正向细胞调节相关通路的下调有关，如T细胞分化、T细胞正向激活和细胞因子产生的正向调节。这种基因表达模式支持了MT-high T细胞作为负向免疫调节因子、可能抑制过度免疫激活的假说。
为了进一步阐明MT-high T细胞的免疫调节作用，我们分析了它们与疾病微环境中其他免疫细胞和上皮细胞的细胞间相互作用。使用CellChat工具，我们发现了MT-high T细胞与中性粒细胞、肺泡巨噬细胞和其他T细胞之间存在强烈的潜在相互作用。为了探索MT-high T细胞功能的时间动态，我们对COPD进展各阶段MT-high T细胞的差异表达基因进行了基因集变异分析。结果显示，在pre-COPD和更晚期COPD患者的MT-high T细胞中，炎症反应、凋亡、缺氧和TGF-β等通路显著富集。这些发现表明MT-high T细胞参与了炎症和氧化应激反应，进一步支持了它们在COPD发病机制中的作用。此外，跨患者组的比较分析揭示了CD8+T细胞中与MT-high T细胞丰度相关的显著功能改变。具体而言，与对照相比，来自pre-COPD和COPD患者的CD8+T细胞显示出细胞因子产生通路（特别是TNF-α信号）的显著上调。基于这些计算洞察，我们通过体外共培养实验进行了直接功能验证。从七名健康志愿者的外周血中通过流式分选分离出MT-high T细胞，并与抗CD3/CD28刺激激活的CD8+T细胞共培养。结果表明，MT-high T细胞具有强大的抑制活性，能够显著抑制激活的CD8+T细胞分泌关键的促炎细胞因子（IFN-γ和TNF-α）。
考虑到MT-high T细胞的潜在免疫调节功能，我们检查了它们是否可能代表调节性T细胞的一个亚型。对Treg标记基因FOXP3的表达评估表明，MT-high T细胞主要为CD3+CD4?CD8?FOXP3?表型，这是DNT细胞的典型特征，而非传统Treg。为了进一步研究这一点，我们对MT-high T细胞和Treg的基因表达谱进行了基因集富集分析比较。只有七个基因在两个群体中均上调，表明MT-high T细胞并非通过Treg的传统免疫调节机制发挥作用。相反，这些细胞很可能代表了一种具有独特免疫调节功能的双阴性T细胞新亚型。+ T细胞增殖的功能验证、ELISA定量细胞因子浓度、Treg相关标记基因表达特征图以及MT-high T细胞与Treg细胞差异表达基因相关性的GSEA分析。">
2.5 MT-high T细胞通过MIF信号通路调节CD8+T细胞的增殖、活化和细胞毒性
对MT-high T细胞的功能分析揭示了它们作为免疫调节细胞的潜在作用，其中观察到MT-high T细胞与各种T细胞亚群之间存在最强烈的相互作用。为了进一步探索这些相互作用，我们使用CellChat工具构建了细胞间通讯网络。我们的分析显示，MT-high T细胞与CD8+T细胞之间的相互作用在配体-受体对的数量和强度方面最为显著，这表明MT-high T细胞在调节CD8+T细胞活性中起主导作用。深入的网络分析进一步证实，MT-high T细胞主要作为信号发送者，而CD8+T细胞是这些信号的主要接收者。肺组织的免疫荧光染色表明CD8+T细胞和MT-high T细胞在空间上相邻，这为我们的scRNA-seq数据发现提供了验证。
聚焦于这些相互作用中涉及的特定配体-受体对，我们确定MIF-(CD74+CXCR4)是MT-high T细胞与CD8+T细胞之间最有效的信号轴。配体-受体弦图分析强调，MT-high T细胞是MIF信号通路的主要贡献者，该通路主要靶向CD8+T细胞。此外，热图显示CD8+T细胞是MIF信号的突出接收者，进一步强调了它们在这种免疫相互作用中的关键作用。为验证这一点，我们首先确认了MT-high T细胞是巨噬细胞迁移抑制因子的重要来源。使用ELISA测量不同细胞培养上清中的MIF蛋白，结果显示，与单独CD8+T细胞培养相比，含有MT-high T细胞的培养物（无论是单独还是与CD8+T细胞共培养）中MIF浓度显著升高。
既往研究表明，MIF可以抑制自身反应性CD8+T细胞的激活和增殖。在本研究中，我们设计了一系列实验来证明MT-high T细胞的抑制作用依赖于MIF。在存在或不存在特定MIF抑制剂和重组人MIF的情况下，将激活的T细胞与MT-high T细胞共培养。MT-high T细胞对增殖和细胞因子产生的抑制效应在添加MIF抑制剂ISO-1后被显著逆转。此外，向ISO-1处理的共培养体系中添加重组MIF可以恢复这种抑制作用。这一观察结果与“MT-high T细胞通过分泌MIF抑制CD8+T细胞的激活和增殖，从而对CD8+T细胞反应产生负向调节作用”的假说一致。
综上所述，这些数据表明MT-high T细胞通过包括MIF在内的多种信号通路调节CD8+T细胞的增殖、活化和细胞毒性。在COPD中观察到的MT-high T细胞比例的进行性下降可能导致CD8+T细胞扩张失控和疾病早期的持续炎症反应。这种失衡可能加剧以进行性COPD为特征的慢性、不可逆炎症。
2.6 COPD中MT-high T细胞的分化和命运
为了研究MT-high T细胞的起源和命运，我们利用Monocle3和RNA velocity工具推断不同T细胞簇的拟时序发育轨迹。基于先验知识，拟时序轨迹的起点被确定为记忆T细胞，位于UMAP图的左下角。从这个初始状态出发，分析揭示了三条不同的T细胞分化途径：记忆T→MT-high T；记忆T→效应CD4+T；记忆T→效应CD8+T。使用RNA velocity，我们观察到记忆T细胞表现出指向MT-high T细胞的方向性箭头，这表明记忆T细胞有分化为MT-high T细胞的倾向。多种轨迹分析方法的一致性支持了MT-high T细胞起源于肺中记忆T细胞、代表不同于CD4+和CD8+T细胞分化分支的假说。
为了探索驱动MT-high T细胞出现及其在疾病状态下减少的因素，我们使用pySENIC工具分析了MT-high T细胞簇和疾病阶段特异性的转录因子谱。我们发现了一个转录因子——KLF13——在MT-high T细胞亚群中与其他T细胞亚群相比显著激活。值得注意的是，KLF13与免疫细胞分化和发育密切相关，表明该转录因子在决定MT-high T细胞命运中起着关键作用。在对照组中，MT-high T细胞表现出几种转录激活因子的上调，包括ZNF319、RXRB和BRF1。这些转录激活因子的显著激活可能解释了MT-high T细胞在我们的对照组患者中比pre-COPD和更晚期COPD患者丰度更高的原因。
为了进一步探索MT-high T细胞在COPD中的功能状态，我们应用T细胞状态识别工具评估了各种T细胞状态。我们的分析表明，COPD的发生和发展与MT-high T细胞的进行性耗竭有关。MT-high T细胞的耗竭可能破坏CD8+T细胞调节的微妙平衡，通过CD8+T细胞的细胞毒性作用加剧组织损伤，这可能进而导致进行性COPD特有的肺实质和小气道的不可逆损伤。
讨论
COPD是一种高度复杂和异质性的疾病，具有广泛的临床表型和不同的疾病轨迹。当前临床管理中最关键的缺陷之一是缺乏识别有疾病发展风险的患者并在症状出现前干预其进展的标准。为了应对这一挑战，我们利用单细胞RNA测序技术，构建了肺功能正常者、pre-COPD和稳定期COPD患者肺组织的全面细胞图谱。该分析揭示了一个新的T细胞亚群，我们将其命名为MT-high T细胞。
这个先前未被识别的T细胞亚群以金属硫蛋白基因的显著高表达为特征，已知这些基因可抵御氧化应激。重要的是，这些细胞的丰度呈进行性下降：在对照受试者中最高，在pre-COPD患者中减少，在确诊患者中进一步减少。这种模式强烈表明这些细胞在预防疾病发生和进展中发挥功能作用。
金属硫蛋白是一个富含半胱氨酸的金属结合蛋白家族，主要参与调节金属离子稳态和减轻氧化应激。现有文献证实MTs在多种肺细胞类型中表达，包括上皮细胞和内皮细胞，它们提供广泛的、可诱导的细胞保护，以抵御颗粒物等环境损伤。除了这种普遍的保护作用外，我们的工作揭示，金属硫蛋白基因程序的组成型高水平表达定义了一种功能特化的T细胞亚型。至关重要的是，与疾病相关的观察是，这种独特装备的T细胞群体在COPD进展过程中被特异性耗竭，表明保护性免疫能力的丧失可能促进疾病发病机制。
我们的功能富集分析显示，MT-high T细胞表现出负向免疫调节功能，可能有助于调节肺微环境中的免疫反应。这些细胞以CD3+CD4?CD8?表型为特征，似乎通过其抑制CD8+T细胞活化、增殖和细胞毒性的能力发挥重要的免疫调节作用，部分通过分泌MIF等信号分子。
为了验证我们基于组织的发现，我们在一个包含80名个体的临床队列的外周血样本中鉴定出了MT-high T细胞。与我们肺组织观察结果一致，我们发现从pre-COPD进展到确诊COPD的患者循环中MT-high T细胞数量呈进行性减少。这一发现强调了它们作为COPD易感性早期且易于量化的细胞标志物的潜力，能够在临床明显症状出现前识别高危个体。
我们的数据支持了MT-high T细胞有助于形成一种保护机制、预防或限制与COPD发病机制相关的炎症改变的假说。当这些调节细胞被耗竭时，由此产生的免疫平衡破坏会导致CD8+T细胞活动不受控制、免疫反应加剧以及随后小气道组织损伤。这种情况为晚期COPD中观察到的CD8+T细胞持续浸润和慢性气道损伤提供了一个新颖且合理的解释。
此外，我们的细胞轨迹推断和转录因子预测分析表明，MT-high T细胞很可能从记忆T细胞分化而来，记忆T细胞是免疫记忆和稳态的核心长寿免疫细胞亚群。这一发现将补充未来研究MT-high T细胞在慢性疾病中的起源和功能特征。
尽管这些发现为免疫调节、COPD发病机制和早期疾病识别提供了新颖且关键的见解，但仍有几个领域值得进一步研究。鉴于MIF功能广泛，详细的机制研究对于阐明MT-high T细胞如何在COPD发病机制中调节MIF信号通路至关重要。具体而言，未来的研究应侧重于描述这些细胞如何减轻最终导致不可逆气道阻塞的慢性炎症和组织重塑的精确分子机制。为了最终确认这些细胞的体内功能，耗竭和过继转移研究将是理想的。然而，实现这一目标的一个主要挑战是缺乏拥有类似于人MT-high T细胞T细胞亚群的合适动物模型。为弥补这一差距，我们为未来研究提出两种战略方法。首先，我们旨在开发在已建立的COPD方案背景下表达关键人金属硫蛋白家族基因的小鼠替代模型。该系统将允许在疾病相关的生理环境中剖析细胞内在功能。其次，我们将尝试将患者来源的、体外扩增的MT-high T细胞过继转移到患有实验性COPD的免疫缺陷小鼠体内。我们预计这些方法将是朝着因果性将这些细胞与免疫病理调节联系起来的关键下一步。此外，我们关于外周循环和肺实质中MT-high T细胞缺陷使个体易患COPD的假说需要通过全面的转化研究进行验证。这些研究应包括肺特异性功能测定、纳入不同人群的扩展横断面队列研究以及前瞻性纵向调查，以确定因果关系并评估MT-high T细胞计数在临床实践中的预测价值。此类研究对于确立该生物标志物的临床效用及其融入常规风险评估方案至关重要。
总之，本研究将MT-high T细胞计数确定为一种在疾病确立前识别有COPD风险个体的潜在方法，同时为未来研究探索揭示了COPD发病机制的新免疫学机制。我们的发现为pre-COPD患者肺组织的全面免疫细胞图谱奠定了基础，为更好地理解pre-COPD背后的免疫学机制提供了关键的理论和实验基础。这些发现为早期识别高危患者和开发新型干预策略开辟了新的潜在途径，代表了向个性化、预防性COPD管理迈出的重要一步。
