《Advanced Science》：FomA-Containing Outer Membrane Vesicles of Fusobacterium Nucleatum Facilitate Bladder Cancer Lymphatic Metastasis via IL-6-Dependent M2b Macrophage Polarization
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本研究发现尿液微生物群中的具核梭菌（F. nucleatum）是膀胱癌淋巴结转移的关键驱动因素。其分泌的外膜囊泡（OMVs）富含外膜蛋白FomA，FomA通过结合膀胱癌细胞上的Toll样受体2（TLR2），激活NF-κB信号通路，上调白细胞介素-6（IL-6）表达。升高的IL-6诱导肿瘤相关巨噬细胞向M2b亚型极化，进而促进血管内皮生长因子C（VEGF-C）的释放，最终驱动淋巴管生成和淋巴结转移。研究还鉴定出天然黄酮类化合物松属素（pinocembrin）可有效抑制FomA-TLR2相互作用，为靶向微生物-宿主互作治疗膀胱癌提供了新策略。
引言
膀胱癌（BCa）是泌尿生殖系统常见的恶性肿瘤，肌肉浸润性膀胱癌（MIBC）具有高淋巴结（LN）转移风险，是患者生存的主要决定因素。近年研究发现，曾被认为是无菌的尿道实际上存在复杂的微生物群，而微生物群失调与多种泌尿系统疾病有关。具核梭菌（Fusobacterium nucleatum, F. n）作为一种革兰氏阴性厌氧菌，已被发现与结直肠癌、乳腺癌等多种癌症的进展相关，其存在也于膀胱癌患者的尿液和肿瘤组织中被检测到。具核梭菌影响肿瘤进展的一个关键机制是通过释放外膜囊泡（Outer Membrane Vesicles, OMVs）。OMVs是来源于细菌外膜的纳米级囊泡，在细菌生理和致病过程中起重要作用。具核梭菌OMVs富含特定的外膜蛋白，其中梭菌外膜蛋白A（Fusobacterium outer membrane protein A, FomA）有助于细菌粘附和侵袭，并可通过与Toll样受体2（Toll-like receptor 2, TLR2）相互作用触发炎症反应。肿瘤微环境中的肿瘤相关巨噬细胞（Tumor-Associated Macrophages, TAMs）表现出显著的可塑性，其功能极化深刻影响肿瘤进展，并与淋巴结转移相关。然而，FomA在肿瘤微环境中的免疫激活或抑制功能，以及FomA、TLR2和白细胞介素-6（Interleukin-6, IL-6）上调之间的相互作用机制尚不清楚。本研究旨在探讨尿液微生物群来源的OMVs对膀胱癌的影响及其潜在机制。
研究结果
1. 具核梭菌丰度与膀胱癌淋巴结转移相关
为了探究膀胱癌患者与健康对照者尿液微生物群组成的差异，研究者对样本进行了16S rDNA测序。维恩图分析显示两组共有572个细菌分类单元，但膀胱癌组的总体微生物丰富度显著更高。α多样性分析中，膀胱癌组的Chao1和Ace指数显著更高。β多样性分析显示两组微生物群落结构存在显著差异。线性判别分析效应量（LEfSe）分析确定梭菌属（Fusobacterium）是膀胱癌组中显著富集的属之一。进一步根据淋巴结转移状态对膀胱癌队列进行分析，发现梭菌属是淋巴结阳性（LN(+)）组相比淋巴结阴性（LN(-)）组最显著富集的属。Kaplan-Meier曲线分析显示，梭菌属丰度升高与膀胱癌患者总生存期降低显著相关。定量PCR分析证实，膀胱癌组织中具核梭菌的丰度显著高于癌旁正常组织，且在LN(+)亚组患者中显著高于LN(-)亚组。这些结果将具核梭菌确定为膀胱癌中关键的尿液和肿瘤相关细菌，并提示其在膀胱癌淋巴结转移中具有潜在的临床意义。
2. 具核梭菌外膜囊泡促进膀胱癌转移
为探究具核梭菌在膀胱癌淋巴结转移中的作用，研究者建立了裸鼠腘窝淋巴结转移模型。小鼠瘤内注射PBS、活菌或热灭活菌。大体检查显示，活菌组小鼠的腘窝淋巴结明显增大。定量分析证实，活菌组的淋巴结显著大于PBS组或热灭活菌组。免疫组化染色显示，与PBS对照组相比，OMVs组小鼠淋巴结中荧光素酶阳性细胞显著增加。为了确定导致这种促转移效应的细菌成分，研究者假设上清液中的分泌代谢物或外膜囊泡可能是功能性效应物。用过滤后的细菌上清液处理膀胱癌细胞会破坏细胞贴附并抑制细胞增殖，但未诱导显著的迁移反应。相反，使用GW4869抑制OMVs分泌并不影响细菌增殖，但显著减少了囊泡的产生，且来自GW4869处理细菌的OMVs促进细胞迁移的能力明显减弱，这表明OMVs是具核梭菌诱导转移潜能的主要介质。透射电镜和纳米颗粒追踪分析对囊泡进行了表征。划痕实验表明，具核梭菌OMVs显著促进了细胞迁移。Transwell实验进一步证明，OMVs处理增强了膀胱癌细胞的迁移和侵袭能力。同时，来自GW4869处理细菌的OMVs的划痕和Transwell实验显示膀胱癌细胞的迁移能力下降。这些发现表明具核梭菌主要通过分泌OMVs对膀胱癌细胞发挥作用。为了在体内进一步验证具核梭菌来源的OMVs的促转移作用，携带腘窝肿瘤的小鼠接受了瘤内注射PBS或OMVs。活体生物发光成像显示，OMVs处理的小鼠比对照组小鼠更早发生淋巴结转移。相应地，OMVs组的淋巴结显著大于PBS组。荧光素酶免疫组化染色进一步证实了OMVs组淋巴结中肿瘤细胞浸润增加。这些结果共同证明，无论在体外还是体内，具核梭菌主要通过分泌OMVs促进膀胱癌淋巴结转移。
3. 具核梭菌OMVs的FomA蛋白促进膀胱癌细胞转移
鉴于OMVs成分复杂，包含脂多糖、蛋白质和核酸等，其具体的活性成分需要进一步验证。OMVs分别用多粘菌素B、DNase I、RNase A或蛋白酶K处理，以选择性降解脂多糖、DNA、RNA或蛋白质。Transwell实验显示，用蛋白酶K处理的OMVs未能显著促进迁移，表明OMVs内的蛋白质是其促转移效应的主要介质。为了鉴定具核梭菌OMVs中可能促进膀胱癌进展的关键蛋白，研究者对OMVs进行了蛋白质组学分析。FomA蛋白表现出最高的相对丰度。鉴于其高表达和潜在的功能重要性，选择FomA进行进一步研究。随后，研究者通过同源重组构建了缺失FomA的突变菌株，并收集了该菌株的OMVs。蛋白质印迹分析证实了突变菌株来源的OMVs中FomA蛋白的减少。为了评估FomA的生物学影响，膀胱癌细胞用PBS、OMVs、缺失FomA的OMVs以及缺失FomA的OMVs补充FomA进行处理。与野生型OMVs相比，缺失FomA的OMVs未能显著促进膀胱癌细胞迁移和侵袭。值得注意的是，补充FomA恢复了缺失FomA的OMVs的促迁移和促侵袭作用。这些结果共同表明，FomA是具核梭菌来源的OMVs的关键功能成分，介导了其在膀胱癌中的促肿瘤活性。
4. TLR2作为FomA的下游受体与膀胱癌不良预后相关
为了进一步探索OMVs诱导膀胱癌进展的分子机制，研究者对用OMVs或PBS处理的膀胱癌细胞进行了RNA测序。RNA-seq数据的KEGG通路分析显示，OMVs处理后Toll样受体信号通路富集。基于先前文章提示FomA与TLR2存在相互作用，研究者分析了公共TCGA数据集以评估TLR2表达在膀胱癌中的临床意义。高TLR2表达与总生存期和無病生存期降低，以及更高的肿瘤分级和分期显著相关。为了研究FomA是否与TLR2相互作用，研究者进行了免疫沉淀实验。重组FomA蛋白能够下拉TLR2，这通过考马斯亮蓝染色和质谱分析得到确认。此外，共免疫沉淀结合蛋白质印迹进一步验证了FomA与TLR2在膀胱癌细胞中的相互作用。免疫荧光显微镜也证明了荧光标记的FomA蛋白与TLR2在细胞膜上的共定位。总之，这些结果表明，FomA作为具核梭菌OMVs的主要蛋白质成分，与TLR2发生物理结合，从而可能促进膀胱癌的淋巴结转移。
5. FomA以TLR2依赖性方式促进膀胱癌淋巴结转移
为了验证TLR2在OMVs介导的表型中的作用，研究者使用shRNA构建了TLR2稳定敲低的膀胱癌细胞系。鉴于其更高的敲低效率，选择了TLR2-sh1用于后续实验。迁移和侵袭实验在四种条件下进行。虽然FomA处理显著增强了对照细胞的迁移和侵袭能力，但这些效应在TLR2敲低细胞中显著减弱，表明TLR2是FomA促迁移和促侵袭作用所必需的。为了进一步评估TLR2在体内的作用，使用表达荧光素酶的膀胱癌细胞建立了两株稳定细胞系。在对照组细胞中，用OMVs或补充了重组FomA的缺失FomA OMVs处理的小鼠，其淋巴结转移发生更早、负荷更重。这些结果表明FomA促进了淋巴结转移。相比之下，TLR2敲低抑制了淋巴结转移，并且在TLR2敲低组中，无论是PBS还是OMVs均未诱导出可检测的转移信号。总之，这些发现证明FomA以TLR2依赖性方式促进膀胱癌淋巴结转移，支持了具核梭菌来源的OMVs通过激活TLR2信号通路驱动转移进展的模型。
6. FomA结合TLR2激活NF-κB信号通路上调IL-6转录
上述研究表明，具核梭菌OMVs通过FomA以TLR2依赖性方式促进膀胱癌细胞的迁移、侵袭和淋巴结转移。为了进一步研究其下游机制，对用OMVs或PBS处理的膀胱癌细胞进行了RNA测序分析。经过滤低丰度基因后，差异表达分析鉴定出28个上调基因和6个下调基因。KEGG通路富集分析显示，细胞因子-细胞因子受体相互作用是OMVs处理后最显著富集的通路之一。一致地，基因集富集分析进一步证实了OMVs处理细胞中细胞因子相关信号通路的显著富集。在差异表达最显著的10个基因中，大多数是细胞因子。为了验证这些发现，研究者针对一组细胞因子进行了定量PCR分析，其中IL6在OMVs刺激下上调最显著。鉴于IL-6是Toll样受体信号下游的经典效应因子，研究者接下来评估了IL-6在膀胱癌中的临床相关性。对TCGA数据库的分析显示，高IL-6表达与总生存期和無病生存期降低显著相关，并且升高的IL6表达与更高的肿瘤分级以及更晚期的T分期和N分期呈正相关。研究者之前的实验表明TLR2和具核梭菌OMVs在功能上参与了促进膀胱癌进展。TLR2的激活诱导经典的NF-κB信号级联反应，这是在癌症中具有重要转录调节作用的经典通路。与此一致，RNA-seq数据的KEGG分析显示OMVs处理后NF-κB信号通路显著富集。为了研究NF-κB是否作为TLR2激活和IL-6上调之间的分子连接，研究者检查了NF-κB1与IL-6表达之间的关系。TCGA数据的皮尔逊相关分析显示NF-κB1与IL6转录水平呈强正相关。在体外，OMVs刺激膀胱癌细胞导致NF-κB1和IL-6表达增加。这种诱导在TLR2敲低细胞中显著减弱，表明OMVs诱导的NF-κB1和IL-6激活依赖于TLR2信号。为了进一步研究NF-κB1对IL-6的转录调控，研究者分析了IL6的启动子区域。JASPAR预测在IL-6启动子上游2000bp区域内存在NF-κB1结合位点。一致地，Cistrome数据库预测显示IL6启动子区域内存在强NF-κB1结合峰。染色质免疫沉淀实验验证了NF-κB1与IL6启动子的直接结合，确认了其转录调节作用。此外，蛋白质印迹分析显示，暴露于OMVs或FomA会导致磷酸化IKK-α、磷酸化p50和IL-6的水平增加。综上所述，这些发现揭示了具核梭菌OMVs在膀胱癌细胞中激活TLR2/NF-κB/IL-6信号轴。
7. 含FomA的具核梭菌OMVs通过IL-6依赖性M2b巨噬细胞招募促进淋巴结转移
在初步的体外实验中，OMVs对膀胱癌细胞增殖的影响极小。然而，体内实验显示OMVs处理显著促进了肿瘤生长，表现为肿瘤体积增加，这表明OMVs可能通过调节肿瘤微环境而非直接影响肿瘤细胞增殖来增强肿瘤进展。一致地，对公共数据集的分析显示，膀胱癌组织中IL-6/TLR2信号与巨噬细胞浸润呈显著正相关。基于这些发现，研究者假设含FomA的OMVs通过调节巨噬细胞招募和极化来促进膀胱癌进展。
膀胱癌细胞用PBS、OMVs、缺失FomA的OMVs或缺失FomA的OMVs补充FomA处理，收集上清液作为条件培养基。用PMA将人单核细胞分化为巨噬细胞样细胞，并暴露于条件培养基中。Transwell迁移实验表明，用来自OMVs或补充FomA的缺失FomA OMVs的条件培养基处理的巨噬细胞，其迁移能力显著增强。此外，来自这些巨噬细胞的条件培养基促进了膀胱癌细胞的迁移。同时，OMVs和补充了FomA的OMVs增强了人淋巴管内皮细胞的管腔形成和迁移，表明了潜在的促淋巴管生成作用。
先前研究表明，M2b巨噬细胞极化通常由免疫复合物或TLR激动剂驱动。鉴于TLR2在具核梭菌介导的膀胱癌进展中的作用，研究者通过将M0巨噬细胞暴露于不同处理组条件培养基中来检测巨噬细胞极化。定量PCR分析显示，用OMVs或补充了FomA的缺失FomA OMVs处理的巨噬细胞中，CCL1和IL-10的表达水平显著增加。这些结果通过ELISA和流式细胞术得到了进一步验证。在动物模型的肿瘤组织中，与对照组相比，OMVs组和补充FomA的缺失FomA OMVs组的CCL1和IL-10表达显著升高。免疫荧光染色进一步证实了这些组肿瘤切片中CCL1和IL-10表达的增加。
此外，为了研究IL-6和TLR2在巨噬细胞极化中的作用，巨噬细胞用来自不同组别的条件培养基处理。PCR分析显示，抑制IL-6信号或TLR2敲低显著降低了CCL1和IL-10的表达，而补充IL-6则使其表达恢复至基线水平。与这些发现一致，极化巨噬细胞分泌的CCL1、IL-6和IL-10增加进一步促进了膀胱癌细胞的迁移。由于肿瘤相关巨噬细胞极化与淋巴管生成相关，研究者接下来检测了VEGF-C的表达，VEGF-C是淋巴管形成和淋巴结转移的关键调节因子。ELISA和qPCR分析显示，TLR2敲低或抑制IL-6信号显著降低了VEGF-C表达，而补充IL-6则恢复了VEGF-C水平。一致地，使用膀胱癌细胞进行的管腔形成和迁移实验进一步支持了该通路介导的促淋巴管生成效应。总之，这些结果表明，含FomA的具核梭菌OMVs通过诱导IL-6依赖性的巨噬细胞向M2b表型极化来重塑肿瘤微环境，从而增强膀胱癌中VEGF-C表达和淋巴结转移。
8. 松属素通过靶向FomA-TLR2相互作用减弱FomA介导的膀胱癌进展
为了进一步研究抑制FomA在膀胱癌中的治疗潜力，研究者进行了计算机虚拟筛选，以鉴定能够干扰FomA-TLR2相互作用的小分子抑制剂。基于针对FomA与TLR2预测结合界面的对接分析，从多个化合物库中初步筛选出31个候选化合物。使用AutoDock Vina，选择了对接分数最高的五个化合物进行进一步的实验验证。在这些候选物中，松属素对FomA相关信号表现出最强的抑制效果。研究者呈现了松属素的化学结构以及FomA-TLR2相互作用界面处FomA与TLR2之间的预测结合区域。确定了候选化合物的半数抑制浓度，并选择了对膀胱癌细胞活力无显著影响的浓度用于后续实验。定量PCR和蛋白质印迹分析表明，松属素处理显著降低了膀胱癌细胞中TLR2、NF-κB1和IL-6的表达。研究者接下来评估了松属素对膀胱癌细胞迁移能力的影响。在20 μM浓度下观察到显著的抑制效果，而10 μM对细胞迁移的影响最小。重要的是，低剂量松属素抑制了膀胱癌细胞生长，而对永生化人膀胱上皮细胞的影响极小。基于这些发现，选择10 μM松属素用于后续与重组FomA的组合实验。与松属素共处理显著减弱了FomA诱导的膀胱癌细胞迁移增强。一致地，体内实验表明，给予松属素显著降低了FomA促进淋巴结转移的能力。为了进一步评估这些发现的转化相关性，研究者从两名有淋巴结转移的膀胱癌患者的肿瘤组织中建立了患者来源的类器官。进行EdU掺入实验以确定合适的松属素浓度，结果显示松属素显著减弱了FomA在膀胱癌类器官中的促转移效应。值得注意的是，瘤内给予松属素在治疗小鼠中未引起明显的毒性或不良反应。总之，这些结果表明松属素通过靶向FomA-TLR2相互作用，有效抑制了膀胱癌细胞迁移和转移进展，突显了其作为膀胱癌治疗药物的潜力。
讨论与总结
本研究提供了全面证据，表明具核梭菌是膀胱癌淋巴结转移的关键微生物驱动因素。研究证明，具核梭菌选择性地富集于淋巴结阳性膀胱癌中，并通过释放外膜囊泡主动促进肿瘤扩散。这些囊泡富含外膜蛋白FomA，其作为微生物信号配体与膀胱癌细胞上的TLR2结合，激活NF-κB依赖性IL-6转录，并整合了肿瘤固有的侵袭性和肿瘤微环境重塑。膀胱作为尿液储存器官，其独特的解剖和生理位置使其持续暴露于微生物产物中。本研究通过进行膀胱癌患者和健康对照者尿液的16S rDNA测序，确定梭菌属是膀胱癌中显著富集的属之一，并且与淋巴结阳性疾病有特别强的关联。这一观察结果得到了肿瘤驻留微生物分析和定量PCR分析的证实。本研究的一个重要见解是，具核梭菌主要通过OMVs而非直接细菌定植发挥其致癌作用。研究发现，用GW4869药物抑制囊泡释放可显著降低膀胱癌细胞的迁移和侵袭，而蛋白酶K处理则显著减弱了OMVs的促肿瘤活性，表明OMVs内的蛋白质货物是肿瘤进展的关键介质。这些发现将具核梭菌来源的OMVs归入一类日益增多的、作为肿瘤生物学主动调节因子的微生物囊泡。因此，进一步探索细菌和整合OMVs可以直接探索微生物在膀胱肿瘤进展中的机制。在不同处理的OMVs中，蛋白酶K组降低了细胞迁移能力，结果表明OMVs中的蛋白质可能在膀胱癌进展中起关键作用。在具核梭菌OMVs中，研究者将FomA确定为主要促肿瘤效应因子。FomA是一种孔蛋白家族蛋白，已知可介导细菌粘附和侵袭、生物膜形成和免疫识别。尽管存在这些认知，但FomA在膀胱癌中的作用此前尚未被探索。来自FomA缺失菌株的OMVs显示出促肿瘤效应减弱，而外源补充FomA则可恢复这些效应，揭示了FomA在OMVs介导的致癌性中的重要作用。本研究表明FomA在OMVs中高度富集。值得注意的是，FomA可能作为TLR2激动剂，这与肠道上皮研究的结果一致，并且足以激活经典的NF-κB信号通路，导致IL-6转录。通过RNA测序和定量PCR分析，研究者发现FomA通过结合TLR2受体激活经典的NF-κB信号通路上调IL-6的表达。IL-6是肿瘤微环境中重要的细胞因子，尤其在促进肿瘤侵袭和转移中起关键作用。通过蛋白质印迹和染色质免疫沉淀实验，研究者证实具核梭菌OMVs激活TLR2，导致NF-κB激活并增强NF-κB与IL-6启动子的结合，从而促进IL-6转录和表达。本研究中，FomA蛋白通过TLR2/NF-κB/IL-6信号通路在膀胱癌进展中起促进作用，这为FomA作为膀胱癌靶向治疗的新靶点提供了理论支持。然而，IL-6不仅直接促进肿瘤细胞迁移，还能促进M2b巨噬细胞极化。在本研究中，来自用具核梭菌OMVs处理的膀胱癌细胞的条件培养基诱导巨噬细胞向M2b表型极化，其特征是CCL1和IL-10表达升高。VEGF-C的表达和分泌也呈现相同趋势。此外，TLR2敲低或IL-6受体阻断降低了条件培养基增强巨噬细胞迁移和淋巴管生成的能力，表明IL-6在TLR2激活下游起关键作用。IL-6是TLR2/NF-κB信号下游的关键炎症介质，不仅直接增强肿瘤细胞迁移，还通过促进巨噬细胞向M2b表型极化主动重塑肿瘤微环境。数据显示，FomA诱导的IL-6促进M2b极化并增强VEGF-C产生。作为淋巴管生成的主要调节因子，VEGF-C促进肿瘤细胞进入淋巴管，从而创造一个有利于淋巴扩散的微环境。最后，将FomA鉴定为可药用的微生物效应因子提供了新的治疗机会。通过结构引导的小分子筛选，研究者鉴定出松属素作为一种化合物，其优先结合FomA上预测的表面口袋，该口袋与TLR2相互作用区域重叠。松属素处理减弱了FomA诱导的NF-κB激活、IL-6表达、巨噬细胞极化和肿瘤进展，支持其作为FomA–TLR2轴抑制剂的功能作用。总之，本研究表明，尿液或肿瘤内检测具核梭菌或FomA可能作为膀胱癌淋巴结转移风险的生物标志物。从治疗角度看，靶向微生物外膜囊泡或其关键效应因子可能是补充现有免疫疗法的一种有前景的策略。
