《Advanced Science》：Biodegradable Carbonate Nanogels Loaded with Anti MFAP-5 siRNA for Anti-stromal Therapy of Hepatocellular Carcinoma
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这篇综述系统评估了一种基于可生物降解聚碳酸酯纳米凝胶（NG）的新型递送系统，用于将靶向微纤维相关蛋白5（MFAP-5）的小干扰RNA（siRNA）递送至癌症相关成纤维细胞（CAF），从而实现肝细胞癌（HCC）的抗基质治疗。研究在肝硬化小鼠HCC模型（C-HCC）中证实，该NG：siMFAP5系统能有效沉默MFAP-5表达、抑制肿瘤血管生成（通过NOTCH/Hes1信号通路）并减少肿瘤生长，且纳米凝胶在CAF中优先摄取，具有良好生物相容性。这项工作为克服HCC治疗瓶颈提供了有前景的CAF靶向RNAi（RNA干扰）策略。
引言背景
肝细胞癌（HCC）是原发性肝癌的主要类型，尤其是在晚期，治疗选择有限。肿瘤微环境（TME）中的癌症相关成纤维细胞（CAF）是促进肿瘤进展的关键因素，因此成为有潜力的治疗靶点。MFAP-5（微纤维相关蛋白5）是一种由炎性CAF（iCAF）表达的促血管生成因子，先前研究已证实其为HCC抗血管生成治疗的一个靶点。小干扰RNA（siRNA）疗法潜力巨大，但其在体内的应用受到药代动力学差、易被RNase降解等限制。纳米载体，如本研究开发的基于聚碳酸酯的纳米凝胶（NG），能够克服这些障碍，实现siRNA的有效递送。
结果与讨论
从嵌段共聚物合成到可生物降解、负载siRNA的纳米凝胶
研究团队开发了新一代阳离子纳米凝胶颗粒（NG），用于将siRNA系统性地递送至肝脏非实质细胞。与基于聚（甲基丙烯酸酯/甲基丙烯酰胺）的前几代纳米凝胶不同，此代NG采用可水解降解的聚碳酸酯主链，提高了生物降解性。其合成过程涉及甲氧基聚乙二醇（mPEG5k）引发5-甲基-5-五氟苯氧基羰基-1,3-二氧杂环己烷-2-酮（MTC-PFP）进行阳离子开环聚合，形成两亲性嵌段共聚物mPEG5k-b-聚（MTC-PFP）。该共聚物自组装成胶束后，核心通过胺敏感的反应性酯基团与亚精胺交联，形成稳定的NG。核心中亚精胺衍生的可质子化仲胺为siRNA的负载提供了条件，而表面的PEG链则保证了生物相容性和对siRNA的保护。
NG与siRNA通过离子相互作用复合，形成NG:siRNA。表征显示，负载siRNA后，NG的Zeta电位从27 mV降至19 mV，粒径也略有减小至约30 nm。RiboGreen检测和琼脂糖凝胶电泳证实，在N:P（氮磷比）为30:1时，siRNA被有效封装。该复合物在生理条件（pH 7.4， 37 °C）和酸性条件（pH 5.5，模拟内体/溶酶体环境）下均会发生生物降解，确保siRNA在细胞摄取后的适时释放。
负载抗MFAP-5 siRNA的生物相容性NG在体外诱导高效敲低
在进入体内研究前，NG在体外进行了生物相容性和siRNA敲低效率评估。MTT实验表明，负载非靶向siRNA（siCTRL）的NG在多种HCC及TME相关细胞系（如mHCC、内皮细胞、成纤维细胞、巨噬细胞、肝星状细胞）中，即使在高浓度下也表现出良好的耐受性。细胞摄取实验显示，负载Cy5标记siRNA的NG:siCy5能被细胞剂量依赖性摄取，且肿瘤细胞（mHCC， hHCC）的摄取水平高于非实质细胞。游离siCy5则几乎不被摄取，凸显了NG递送的必要性。共聚焦显微镜证实NG被有效内化，且与酸性溶酶体区室共定位极少，表明其能有效逃逸内体，这对于功能性siRNA递送至关重要。
为了模拟CAF活化，研究将成纤维细胞（NIH/3T3）与小鼠HCC细胞（Dt81Hepa1-6）共培养，成功诱导了成纤维细胞中MFAP-5表达的上调。向该共培养体系加入负载抗MFAP-5 siRNA（siMFAP5）的NG（NG:siMFAP5）后，可在mRNA和蛋白水平上剂量依赖性地抑制MFAP-5表达，效果甚至优于商业转染试剂Dharmafect。
NG在（非）肝硬化HCC小鼠模型中有效将siRNA转运至肝CAF
研究采用了模拟临床情况的肝硬化HCC小鼠模型（C-HCC）和非肝硬化HCC模型（HCC）。通过近红外活体成像技术追踪负载Cy5.5标记siRNA（siCy5.5）的NG:siCy5.5的体内分布。结果显示，静脉注射后，NG:siCy5.5在肝脏中强烈积聚，而游离siCy5.5信号迅速消退，表明NG显著改善了siRNA的药代动力学和肝脏靶向性。在器官水平，NG:siCy5.5在HCC小鼠肝脏的积累高于C-HCC小鼠，可能与肝硬化伴随的组织硬化和异常血管结构有关。然而，在细胞水平，通过流式细胞术分析酶解肝脏的单细胞悬液发现，NG:siCy5.5在两种模型小鼠的CAF（α-SMA+细胞）、树突状细胞和巨噬细胞中均有摄取，且在CAF中的摄取最高，且两组间无显著差异。这表明NG能有效将siRNA递送至TME中的CAF。急性毒性实验表明，NG:siCTRL在小鼠中耐受性良好，未引起急性肝、肾损伤或明显的免疫反应。
MFAP-5敲低可减轻C-HCC小鼠肝脏肿瘤负荷
在C-HCC模型中评估NG:siMFAP5的治疗效果。小鼠在肿瘤接种后第21、23、25天接受三次静脉注射NG:siMFAP5（对应siMFAP5剂量为0.5或1 mg kg?1）。对照组接受NG:siCTRL或生理盐水。结果显示，NG:siMFAP5能剂量依赖性地降低肝脏肿瘤负荷，表现为肝脏重量减轻和H&E染色切片中肿瘤面积的缩小。组织学分析证实了肿瘤负荷的显著减少。同时，在蛋白和mRNA水平上均检测到MFAP-5表达的剂量依赖性敲低，尤其在CAF中敲低效果更为显著。流式分析显示，MFAP-5敲低效应也见于其他TME细胞类型，但表达水平较低，表明主要治疗效应源于对CAF的靶向。
MFAP-5敲低通过干扰NOTCH/Hes1信号通路减少肿瘤血管生成
为进一步探究机制，研究检测了经NG:siMFAP5（高剂量）治疗后小鼠肝脏组织中血管生成和细胞外基质（ECM）相关标志物的表达。RT-qPCR显示，胶原蛋白Iα1（Col1α1）、CD34和血管内皮生长因子（VEGF）的表达均显著下调，提示MFAP-5敲低抑制了血管生成。RNA测序（RNA-seq）分析进一步揭示了治疗后基因表达谱的变化：促凋亡和细胞死亡相关基因（如Adamts16， Car3）上调，而促肿瘤和免疫抑制基因（如Afp）以及细胞分化、生长、迁移相关基因（如Hes1， Wif1， Frmd7）下调。通路富集分析（IPA）显示，与血管生成、肿瘤生长相关的通路受到抑制，而与免疫监视、ECM重组相关的通路被激活。鉴于Hes1（NOTCH信号通路下游靶基因）的下调，研究聚焦于NOTCH/Hes1通路。RNAscope原位杂交显示，Hes1在C-HCC小鼠的肿瘤（Tu）区域和胆管周围高表达，而在肿瘤周围组织（ST）中表达较低。体外实验发现，重组MFAP-5（rMFAP5）处理对人/鼠内皮细胞和HCC细胞产生相反的效应：在内皮细胞中下调Hes1并上调CD34、CD105等血管生成标志物；在HCC细胞中则上调Hes1和肿瘤标志物AFP。这种细胞特异性效应可能与MFAP-5通过整合素αvβ3受体（在内皮细胞上高表达）抑制NOTCH信号有关，抑制剂实验支持了这一机制。
MFAP-5在HCC患者TME的炎性CAF中高表达
为验证临床相关性，研究分析了HCC和胆管癌（CCC）患者手术样本中的MFAP-5表达。RNAscope检测显示，MFAP-5在肿瘤基质（ST）和瘤内血管周围区域高表达，与小鼠模型观察一致。进一步利用公开的人类HCC单细胞RNA测序数据分析发现，MFAP-5主要在成纤维细胞簇中表达，其次是髓系细胞和内皮细胞。对成纤维细胞亚群的分析揭示，MFAP-5高表达于炎性CAF（iCAF），而基质CAF（mCAF）中表达较少，血管CAF（vCAF）和抗原呈递CAF（apCAF）则不表达。这确立了iCAF是HCC中MFAP-5的主要细胞来源。
结论
本研究开发了一种新型的可生物降解聚碳酸酯纳米凝胶（NG），用于向CAF靶向递送抗MFAP-5 siRNA，为HCC的抗基质治疗提供了新策略。该NG系统具有良好的生物相容性、高效的细胞摄取和内体逃逸能力。在临床相关的肝硬化HCC小鼠模型中，NG:siMFAP5能有效积累于肝脏并被CAF摄取，实现剂量依赖性的MFAP-5敲低，从而抑制NOTCH/Hes1介导的肿瘤血管生成，显著降低肿瘤负荷。MFAP-5在人类HCC和CCC的肿瘤基质中，特别是iCAF中高表达，其作用机制在人和小鼠模型中具有保守性，凸显了该靶点及纳米凝胶递送系统的转化潜力。这项工作为HCC，尤其是晚期HCC的治疗，提供了一种有前景的CAF靶向RNAi补充治疗方案。
