《Journal of Hazardous Materials》：Microbial mechanisms of protein degradation and nicotine removal during aerobic composting of tobacco waste as the sole nitrogen source
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烟草废弃物好氧堆肥中尼古丁降解机制及微生物群落研究。采用鲜烟草叶作唯一氮源，发现Bacillota和Pseudomonadota丰度较高，通过S8家族蛋白酶降解蛋白质，并经吡咯烷途径由Stutzerimonas stutzeri和Pseudomonas sp.快速降解97%以上尼古丁，产物肥效优于牛粪。
张洪|杜永梅|关恩森|徐秀红|张鹏|高立伟
中国农业科学院烟草研究所，中国青岛市266101
摘要
由于烟草废弃物中含有高浓度的尼古丁，其大量积累对环境安全和人类健康构成了威胁。虽然好氧堆肥是一种有效的废弃物生物质管理策略，但将其应用于新鲜废弃的烟草叶子的研究尚未见报道。本研究首次将烟草叶子用于好氧堆肥，并探讨了驱动底物转化的微生物机制。废弃的烟草叶子富含蛋白质，可以作为堆肥的唯一氮源。与牛粪堆肥相比，该过程中芽孢杆菌门（Bacillota）和假单胞菌门（Pseudomonadota）的丰度较高，而放线菌门（Actinomycetota）的丰度较低。烟草叶子中蛋白质的降解主要由芽孢杆菌门分泌的蛋白酶（如S8、S9、M42家族）介导。值得注意的是，S8家族蛋白酶的丰度更高，其中两种蛋白酶具有较大的底物腔体积。在初始发酵过程中，尼古丁含量迅速下降，去除率超过97%，符合欧盟的安全标准。这种降解主要通过Stutzerimonas stutzeri和Pseudomonas属菌株的吡咯烷途径实现。种子发芽和盆栽实验表明，发酵后的烟草叶子比牛粪产品具有更强的促进生长作用。这些发现阐明了烟草废弃物发酵的微生物机制，并为筛选高效尼古丁降解菌株和开发增值发酵产品提供了理论基础。
引言
作为全球重要的经济作物，烟草的种植面积非常广泛，尤其是在中国，年种植面积超过150万公顷[1]。然而，对大量烟草种植残余物的不当管理（包括结构优化的废弃新鲜底叶以及受病虫害损害的植物）带来了环境风险[2]。这些残余物含有丰富的碳水化合物（纤维素、木聚糖、阿拉伯糖等）、蛋白质、生物碱（95%为尼古丁）、矿物质和维生素[3]。然而，由于其高浓度的尼古丁（0.66–25.40 mg/g）[4]，这些残余物的生态价值受到严重限制，超过了欧盟“有毒和危险废物”的阈值（0.5 mg/g）[5]。鉴于全球对环境安全问题的日益关注，降低烟草废弃物中的尼古丁含量已成为一项紧迫的研究课题。
好氧嗜热堆肥是一种生态高效的有机废物处理技术，它利用微生物的分解作用将复杂的有机物转化为富含营养的生物肥料，同时有效降解抗生素和重金属等污染物[6][7]。这一过程的效率取决于微生物群落的演替，而微生物群落的组成（C/N比、水分、颗粒大小）对此有重要影响。关于烟草废弃物处理的研究已经探讨了其作为独立堆肥材料或共堆肥成分的可行性。例如，以8:2的比例堆肥废弃的烤烟叶和烟茎可使尼古丁含量从1.29%降至0.28%[8]；与富含氮的蔬菜废弃物共堆肥可提高堆肥效率并加速尼古丁的降解[9]。此外，从烟草热解中获得的生物炭作为食物废弃物消化物堆肥的添加剂，已被证明可以显著减少氮的损失[10]。然而，大多数现有研究将烟草仅作为碳源补充物。当高氮含量的烟草作为堆肥系统中的唯一氮源时，其特有的高尼古丁浓度如何影响并塑造特定的核心功能微生物群落尚不清楚，这些微生物群落驱动的生物降解机制也尚未明确，这构成了一个关键的研究空白。
从各种环境中分离出了许多能够降解尼古丁的微生物，包括烟草种植土壤、废弃物和活性污泥中的微生物，其相关的生物降解途径也已被研究[11]。研究主要揭示了三种细菌降解途径：革兰氏阳性细菌（如Paenarthrobacter nicotinovorans pAO1）中的吡啶途径，涉及关键酶尼古丁脱氢酶（Ndh）、6-羟基尼古丁氧化酶（6-HLNO）、6-羟基假氧尼古丁脱氢酶（Kdh）和2,6-二羟基假氧尼古丁水解酶（DHPONH）[12]；革兰氏阴性细菌（如Pseudomonas属）中的吡咯烷途径，涉及尼古丁氧化还原酶（NicA）和3-琥珀酰吡啶单加氧酶（Spm）[13]；以及革兰氏阴性物种（包括Agrobacterium tumefaciens S33）中的变体吡啶-吡咯烷途径（VPP途径）[14]。6-羟基假氧尼古丁氧化酶（Pno）和醛脱氢酶（Ald）是连接吡啶途径和吡咯烷途径的两个特征酶[15]。此外，还记录了Aspergillus oryzae 112822中的真菌降解途径[16]。尽管取得了这些进展，但对许多尼古丁降解物种（如Rhizobium属、Bacillus属）的分解机制仍了解有限。分离出高效降解菌株具有重要的生物修复潜力，但系统地鉴定控制堆肥系统中尼古丁分解的微生物群落仍是一个关键的研究方向。
本研究使用废弃的新鲜烟草叶子作为与农业废弃物共堆肥的唯一氮源，结合宏基因组学和宏蛋白质组学方法揭示了发酵过程中的微生物机制，旨在：（i）表征好氧发酵过程中的微生物群落结构和功能降解组；（ii）解码参与尼古丁降解的关键功能基因和代谢途径；（iii）鉴定能够降解尼古丁的功能菌株。阐明这些过程不仅有助于理解微生物降解的生态影响，还能为烟草废弃物的解毒、资源回收和增值利用提供新的策略。
发酵设计
发酵实验在中国山东省青岛市屯农有机肥料有限公司（36°79′N, 120°08′E）进行。新鲜烟草底叶（含水量83%；C/N比为12）来自潍坊烟草公司的诸城芦庄实验站。由于其高氮含量，这些叶子被创新性地与农业废弃物共同堆肥作为氮源。当地采购了玉米芯和花生壳作为填充剂以优化堆肥过程。
发酵过程中物理化学性质和尼古丁残留物的变化
设置了三种处理方式（TP、CP、TC），以研究不同氮源（烟草叶子 vs. 牛粪）在同一碳源下的影响，以及不同碳源（花生壳 vs. 玉米芯）与烟草叶子作为氮源对堆肥过程物理化学参数的影响。温度是好氧发酵的关键指标。所有三种处理方式在两周内均保持温度高于60°C（图1A）。
结论
本研究采用宏基因组学和宏蛋白质组学方法阐明了新鲜烟草废弃物在高温好氧发酵过程中的微生物降解机制和尼古丁转化途径。在整个过程中，芽孢杆菌门始终是主导的菌门，其次是假单胞菌门。底物的降解通过芽孢杆菌门分泌的蛋白酶和碳水化合物活性酶的协同作用实现。
环境影响
本研究关注的是含有高浓度尼古丁（0.66–25.40 mg/g）的烟草废弃物，尼古丁是一种强效的生物碱神经毒素。由于尼古丁具有高水溶性，从废弃烟草中渗入土壤和水生系统会导致微生物和植物急性中毒，破坏生态平衡。根据欧盟法规，尼古丁含量超过0.5 mg/g的烟草废弃物被视为危险物质。我们的研究采用好氧发酵有效降解了新鲜废弃物中的尼古丁。
作者贡献声明
张鹏：项目监督、项目管理、资金获取、概念构思。高立伟：写作 – 审稿与编辑、监督、资源协调、项目管理。徐秀红：验证、监督、项目管理。杜永梅：监督、资源协调、方法学设计。关恩森：资源协调、方法学设计、数据分析。张洪：写作 – 原稿撰写、数据可视化、方法学设计、实验设计、数据管理、概念构思。
利益冲突声明
作者声明他们没有已知的利益冲突或个人关系可能影响本文的研究结果。
致谢
本研究得到了中国烟草总公司重大科技项目（110202201005）、青岛市博士后计划（QDBSH20240202118）和中国农业科学院农业科技创新计划（ASTIP-TRIC-05）的支持。
