《Journal of Hazardous Materials》：Ammonia-Induced Exosomal miRNA Disrupts Autophagy and Promotes Lung Injury: Therapeutic Potential of Natural Compounds
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本研究利用肉鸡和原代AT-II细胞模型，揭示氨气暴露通过释放携带miR-20a-5p的外泌体，抑制自噬流并激活AKT/mTOR通路，加剧炎症和凋亡。筛选出芦丁和黄连素可有效逆转上述病理过程，为农业环境中肺损伤的防治提供天然产物新策略。
作者：韩云、李世英、杨健、费利克斯·夸梅·阿梅沃尔、阿桑努尔·卡比尔医学博士、赵晓玲、王英杰
中国四川省成都市四川农业大学动物科学与技术学院猪禽育种产业国家重点实验室，邮编611130
摘要
氨（NH?）是一种普遍存在的农业排放物，通过呼吸道损伤对人类和牲畜构成重大风险。然而，氨诱导的肺损伤的分子机制尚未明确，相应的干预措施也尚未开发出来。本研究使用肉鸡和原代II型肺泡细胞（AT-II细胞）来探讨致病途径及潜在的保护因子。暴露于氨环境中的AT-II细胞释放的外泌体（NH?-exo）富含miR-20a-5p，该分子可直接作用于PTEN蛋白，激活AKT/mTOR信号通路，并抑制自噬过程，从而加剧炎症和细胞凋亡。在体外和体内实验中，敲低miR-20a-5p的表达可缓解这些不良反应。通过对六类天然化合物的筛选，发现木犀草素（黄酮类）和小檗碱（生物碱）具有最强的保护作用，能够恢复自噬功能并减轻炎症和细胞凋亡反应，其效果与雷帕霉素相似。本研究证实外泌体中的miR-20a-5p是氨毒性的关键介质，并指出黄酮类和生物碱是缓解氨诱导的呼吸道损伤的天然候选物质，对农业和环境健康具有重要的应用价值。
引言
氨（NH?）是一种主要的大气污染物，主要来源于牲畜粪便的分解和化肥的使用[32]。随着农业的集约化发展，全球氨排放量显著增加，导致环境中氨浓度升高，对人类和牲畜造成双重威胁。农民和畜牧业工作者在处理粪便和施肥过程中经常暴露于氨气中[27][36]，而圈养的家禽和其他农场动物则长期处于高浓度氨环境中[34]。这种持续暴露会损害呼吸功能并降低生产性能，使氨成为重要的环境和职业健康危害[33]。尽管氨吸入引起的病理后果（如上皮细胞损伤、炎症和慢性肺重塑）已被广泛认识[3]，但其背后的分子机制仍不明确。最新研究表明，细胞外囊泡（尤其是携带微小RNA（miRNA）的外泌体）在肺损伤的细胞间通讯中起关键作用[15][9]。受损的上皮细胞会分泌富含miRNA的外泌体，这些外泌体可在受体细胞中放大炎症和细胞凋亡反应，但其对氨毒性的具体作用尚未明确。自噬是维持肺稳态的关键过程，能够清除受损细胞器并调节蛋白质代谢[41]；自噬功能障碍与慢性阻塞性肺疾病、特发性肺纤维化和急性肺损伤密切相关[1]。实验证据表明，氨会干扰自噬过程，表现为线粒体损伤、自噬体积累增加以及自噬相关基因表达改变[33][8]。这些发现提示自噬功能障碍可能介导氨诱导的肺损伤，但缺乏直接的机制证据。鉴于此，研究者开始关注能够调节自噬的潜在干预措施。天然化合物（尤其是黄酮类和生物碱）具有抗炎和抗氧化作用，并可通过mTOR、AMPK和Nrf2等通路调节自噬[11][12][13][17][2][23]。例如，槲皮素和姜黄素可保护肺细胞免受污染物损伤[2][28]，而小檗碱可增强自噬并防止有毒蛋白质积累[23][29]。尽管这些化合物具有潜力，但其对氨诱导的肺损伤的保护效果尚未得到系统评估。
研究目的
本研究旨在：（i）阐明氨暴露导致肺损伤的分子机制，重点关注自噬相关信号通路及外泌体miRNA的作用；（ii）评估天然化合物的治疗潜力。通过使用肉鸡模型和原代II型肺泡细胞，筛选六类具有生物活性的化合物（黄酮类、多酚类、萜类、生物碱、多糖和醌类），探讨其缓解氨诱导损伤的能力。通过结合机制研究与化合物分析，本研究加深了对氨诱导的肺毒性的理解，为基于天然产物的干预措施提供了理论依据，对畜牧业生产和环境健康具有重要意义。
细胞培养与氨暴露模型
HD11细胞系是一种由禽类髓细胞瘤病毒（MC 29）转化而来的鸡巨噬细胞类似细胞系，由吉林大学提供。该细胞在含有10%胎牛血清（FBS，Gibco，Invitrogen）的DMEM培养基中，于39℃、5%二氧化碳环境下培养。
原代II型肺泡上皮细胞（AT-II细胞）的制备方法参考了我们之前建立的方案[42]：从14天大的白来航无特定病原体（SPF）鸡胚胎中取出肺部组织并切碎。
氨暴露导致肺损伤
为探讨氨暴露的病理效应，我们首先研究了鸡原代II型肺泡上皮细胞（AT-II细胞）和肺组织。实验结果显示，氨处理会导致AT-II细胞出现明显的空泡化和细胞凋亡（图1A）。组织学分析显示，肺泡隔膜变窄，淋巴细胞浸润增加（图1B）。此外，氨暴露还显著增强了促炎细胞因子的表达。
讨论
本研究揭示了氨暴露如何引发肺损伤的分子机制：氨暴露会促使肺泡上皮细胞释放外泌体，这些外泌体富含miR-20a-5p。受体细胞摄取NH?-exo后，miR-20a-5p通过抑制PTEN蛋白和激活AKT/mTOR通路，增强炎症细胞因子的释放并抑制自噬过程。体内实验表明，NH?-exo的给药会加重肺损伤，而外泌体则具有保护作用。
伦理批准与参与同意
本实验方案获得了四川农业大学动物护理与使用委员会的批准，并遵循美国国立卫生研究院关于实验室动物护理与使用的指南（NIH Publications No. 8023，1978年修订版）进行。
环境影响
氨是主要的农业排放物，对空气质量、动物福利和职业健康具有危害。本研究利用相关的家禽和细胞模型证实，外泌体中的miR-20a-5p可介导氨诱导的自噬障碍、炎症和肺损伤。发现黄酮类和生物碱具有有效的保护作用，表明它们是减轻呼吸道毒性的可持续天然策略。
作者贡献声明
韩云：负责实验设计。
杨健：负责方法学研究。
李世英：负责方法学研究及实验设计。
阿桑努尔·卡比尔医学博士：负责写作、审稿与编辑工作，以及初稿撰写。
费利克斯·夸梅·阿梅沃尔：负责写作、审稿与编辑工作，以及初稿撰写。
王英杰：负责写作、初稿撰写、实验监督及资金筹集。
赵晓玲：负责数据验证、实验监督及资金筹集。
利益冲突声明
作者声明不存在可能影响本研究结果的财务利益冲突或个人关系。
致谢
本研究得到了四川省自然科学基金青年项目（2025ZNSFSC0973）、中国博士后科学基金（2025M770272）、国家博士后研究资助计划（GZC20252329）以及四川省国家现代农业产业技术创新团队（SCCXTD-2025-24）的支持。
