微生物产生的N?O以及受地下水流动模式调控的功能性微生物群落

江汉平原地下水流动方向调控N?O生成机制及功能菌群，通过1?N同位素示踪、宏基因组及qPCR分析发现补给区氨氧化古菌（AOA）主导贡献66% N?O，排泄区异养反硝化贡献92%，norB基因缺失表明反硝化菌群产N?O能力有限，揭示了地下水流动通过红ox梯度与底物浓度调控N?O生产路径及菌群演替规律。

　　

王亚琪|王海琳|张琳|韩宇|李萍|王彦鑫

中国地质大学地球微生物学与环境变化国家重点实验室，武汉430074，中华人民共和国

摘要

由于地下水中的活性氮过程以及地下水抽取和自然排放，地下水可能是氧化亚氮（N₂O）的一个重要来源。然而，调节地下水流动模式下N₂O产生的机制仍不甚明了。本研究结合了¹⁵N同位素追踪、宏基因组分析、定量聚合酶链反应（qPCR）和微生物培养技术，探讨了中国江汉平原地下水系统中N₂O的产生途径及相关的微生物群落。在补给区，主要由氨氧化古菌（AOA）介导的氨氧化作用是N₂O的主要来源，铵氮（NH₄⁺-N）贡献了总量的66%。在排放区，异养反硝化作用是主要途径，硝酸盐氮（NO₃^?-N）占N₂O产生的92%。宏基因组分析证实了关键功能基因（amoA, nir, norB）的分布差异，并发现硝化微生物中普遍缺乏norB基因，表明它们通过硝化反硝化作用产生N₂O的能力有限。排放区观察到的高N₂O浓度和产生速率进一步表明该区域是N₂O产生的热点，具有较高的后续排放潜力。本研究表明，微生物N₂O的产生及其相关功能群落受地下水流动驱动的生物地球化学梯度的调控。这些发现有助于我们更好地理解地下N₂O的产生机制，并强调了地下水系统在区域和全球N₂O预算中的重要性。

引言

作为第三大强效温室气体，氧化亚氮（N₂O）的百年全球变暖潜能是二氧化碳（CO₂）的273倍，其大气寿命为114年，对全球气候变化构成严重威胁（Prather等人，2015年；Weber等人，2024年）。人类活动，如农业施肥（Zhou等人，2019年）和废水排放（Mora等人，2022年），向地下水系统引入了大量活性氮，为N₂O的生成提供了物质基础。地下水系统的独特水文地球化学环境为N₂O的产生创造了有利条件，使其能够持续积累并达到饱和状态（Jahangir等人，2013年）。过饱和的N₂O通过井抽水和自然排放到地表水中，成为N₂O的重要排放源（Qian等人，2025年；Sadat-Noori等人，2016年）。关键的是，地下水与河流、湖泊或湿地不同，它具有较长的水力停留时间、缺乏光照，并且在广泛的地下流动路径中形成了相对稳定的氧化还原梯度（Liu等人，2024年；Saccò等人，2024年）。这些条件促进了独特的微生物过程和N₂O积累动态，使其成为一个独特且持久的生物地球化学反应器。

地下水系统通过补给、流动和排放等水文过程调节氮物种和氧化还原状态的动态变化（Gan等人，2018年；Liang等人，2020年）。其中，地下水流动方向是塑造一系列过程的核心驱动力，沿流动路径建立了连续的氧化还原梯度：在补给区，相对充足的溶解氧（DO）形成了以硝化作用为主的微好氧环境（Han等人，2023年；Su等人，2020年）；在排放区，厌氧和还原条件有利于反硝化作用和异化硝酸盐还原为铵（DNRA）（Jorgensen等人，2009年；Smith等人，2017年；Tesoriero等人，2000年）。这种由流动场主导的环境差异决定了氮转化的空间模式。地下水流动方向还影响功能微生物群落的结构演替（Wang等人，2024a）。我们最近的研究表明，地下水流动引起的活性氧（ROS）波动会影响功能微生物（如氨氧化古菌（AOA）和氨氧化细菌（AOB）的演替（Wang等人，2023a）。因此，地下水流动方向通过调节关键环境因素（包括氧化还原电位、底物可用性（例如铵（NH₄⁺）和硝酸盐（NO₃^?）以及水力停留时间）来控制氮循环的空间结构（Chen等人，2023年；Li等人，2021a）。这些因素共同决定了流动路径上硝化或反硝化作用的主导地位及其相关的N₂O产量。

地下水流动建立的氧化还原梯度控制着驱动更广泛氮循环的微生物活性，其中包括氮固定、硝化、反硝化和厌氧铵氧化（anammox）等关键过程。其中，硝化（特别是氨氧化）和反硝化是N₂O的主要生物来源（Kuypers等人，2018年）。因此，量化它们各自的贡献对于理解地下水流动如何调节N₂O的产生至关重要。然而，系统地了解地下水流动方向如何调节不同N₂O产生途径之间的转换以及相关微生物群落的响应仍不甚清楚。一个主要障碍在于难以定量划分这些共存途径的贡献（Li等人，2024年；Stuchiner和von Fischer，2022年）。最近的方法学进展为直接追踪和量化特定微生物过程提供了新的方法。例如，¹⁵N富集同位素追踪可以直接追踪氮从特定前体（如NH₄⁺或NO₃^?）到N₂O的流动过程，从而计算出特定途径的贡献（He等人，2026年；Wan等人，2023年）。包括选择性微生物抑制剂、功能基因的定量聚合酶链反应（qPCR）和宏基因组分析在内的综合方法，提供了一个强大的框架，将水文区域与量化的N₂O产生机制及其微生物作用者联系起来（Huang等人，2023年；Masta等人，2024年；Wang等人，2024b）。

因此，本研究聚焦于中国江汉平原的含水层系统。该地区由于其密集的农业氮负荷、由活跃的补给和排放过程驱动的动态氧化还原波动以及明确的地下水流动路径，是一个理想的自然实验室（Du等人，2017年；Zhang等人，2023年）。通过结合先进的方法，特别是¹⁵N同位素追踪、抑制剂测定、宏基因组学和qPCR，以及现场和实验室研究，本研究旨在：（i）揭示N₂O产生的功能途径，探讨不同途径的贡献及其受地下水流动驱动的空间差异模式；（ii）描述受地下水流动影响的N₂O产生功能微生物群落的演变（包括定量和多样性分析）。这项工作通过系统地将地下水流动方向与N₂O产生途径的定量划分及其相关功能微生物群落联系起来，提供了新的见解，并强调了地下水系统在区域和全球N₂O预算中的重要性。

研究区域描述

研究区域位于长江湿润的中游，属于亚热带季风气候，年降水量为1100–1300毫米（其中约50%发生在5月至8月），年蒸发量为1200–1400毫米（Du等人，2017年）。含水层系统由第四纪未固结沉积物组成，包括全新世和上更新世的粘土、粉质粘土和淤泥。浅层沉积物的厚度逐渐增加

沿地下水流动路径的水文化学和氧化还原演变

沿地下水流动路径，观察到了水文化学条件的系统变化（图2a）。相应的氮物种变化包括NO₃^?的显著减少和NH₄⁺的显著积累，而NO₂^?的浓度始终保持较低。总氮（TN）最初下降后随后上升。同时，溶解氧（DO）和氧化还原电位（ORP）持续下降，Fe²⁺、DOC和N₂O的浓度沿流动路径逐渐增加

受地下水流动方向控制的N₂O产生的空间差异

通过整合水文化学梯度、¹⁵N追踪N₂O产生途径、功能基因丰度、基于抑制剂的微生物定量以及宏基因组群落谱型，本研究明确了N₂O产生的差异并非由孤立的环境因素随机驱动，而是主要由地下水流动方向塑造的氧化还原条件和底物浓度梯度所决定。

传统解释通常将N₂O的产生归因于静态的局部条件

CRediT作者贡献声明

王亚琪：撰写——初稿、可视化、方法学、数据管理。王海琳：可视化、方法学、数据管理。张琳：方法学、调查。韩宇：可视化、方法学。李萍：撰写——审稿与编辑、监督、资源获取、概念化。王彦鑫：撰写——审稿与编辑、资金获取。

利益冲突声明

作者声明他们没有已知的可能会影响本文工作的财务利益或个人关系。

致谢

本研究得到了国家自然科学基金（编号：42177068）和国家重点研发计划（编号：2021YFA0715900）的支持。