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hRSAD1蛋白被纯化并证实含[4Fe-4S]簇，可特异性结合PPIX及其金属衍生物，并吸附O2、CO、CN，提示其在血红素代谢调控中的潜在作用。
Oleg A. Zadvornyy | Mikhail Drobizhev | Monika Tokmina-Lukaszewska | Eric M. Shepard | William E. Broderick | Joan B. Broderick
蒙大拿州立大学化学与生物化学系，博兹曼，MT 59717，美国
摘要
人类自由基S-腺苷-l-甲硫氨酸结构域1（hRSAD1）是一种最近发现的线粒体蛋白，在细胞功能中扮演着重要但尚未完全理解的角色。hRSAD1属于庞大的S-腺苷-l-甲硫氨酸（SAM）超家族酶，这类酶利用氧化还原活性[4Fe-4S]簇和SAM来启动自由基催化反应。此外，hRSAD1还含有一个潜在的血红素结合结构域。hRSAD1已在E. coli中表达并纯化至均一状态。纯化的hRSAD1与[4Fe-4S]2?簇重新组装后可以被还原为[4Fe-4S]?状态，并通过紫外-可见光谱和电子顺磁共振（EPR）光谱进行了表征。研究显示hRSAD1能够结合卟啉类物质，包括原卟啉IX（PPIX）及其金属衍生物（如Fe2?-PPIX、Fe3?-PPIX和Zn2?-PPIX）。通过紫外-可见光谱和荧光光谱测定，Fe3?-PPIX与hRSAD1的结合常数K_A为K_A = (1.6 ± 0.3) × 10^6 M?1。此外，hRSAD1-[4Fe-4S]-血红素复合物还能结合氧气、一氧化碳和氰化物。这些发现表明hRSAD1可能在血红素相关的代谢过程中发挥重要作用。
引言
人类S-腺苷-l-甲硫氨酸（SAM）结构域1蛋白（hRSAD1）属于庞大的SAM超家族酶，该家族酶利用[4Fe-4S]簇和SAM来启动自由基催化反应[[1], [2], [3], [4], [5], [6]]。SAM超家族包含超过20个酶群，具有广泛的催化功能[[7,8]]。SAM酶具有完整的α?/β?或部分的α?/β? TIM（三磷酸异构酶）桶状结构，其中包含CX?CX?C基序，用于协调[4Fe-4S]簇中的三个铁原子（C代表半胱氨酸，X代表其他氨基酸）。第四个“独特”的铁原子由SAM的羧基和氨基团簇合[[10], [11], [12]]。RS催化反应始于还原态[4Fe-4S]?簇向SAM磺鎓的电子转移，导致S-C(5′)键断裂，生成一个有机金属中间体Ω，其中SAM分子的腺苷基团通过其5′-C与[4Fe-4S]3?簇的独特铁原子共价结合[[13,14]]。随后的Fe-C5′键断裂产生高活性的5′-脱氧腺苷自由基（5′-dAdo•），该自由基通常通过从底物中抽取氢原子来引发催化反应[[15], [16], [17], [18], [19]]。
包括hRSAD1在内的多种SAM酶在人类健康和疾病中起着重要作用[[4]]。例如，MOCS1A催化5′-鸟苷三磷酸转化为环状吡喃opterin单磷酸，这是钼辅因子（MoCo）生物合成中的关键步骤，而钼辅因子是某些酶（如亚硫酸氧化酶）所必需的[[20], [21], [22]]。脂酰合成酶的缺乏（一种对硫辛酸生物合成至关重要的SAM酶）会导致突变小鼠的氧化应激增加并加速糖尿病神经病变[[24]]。RS酶CDK5RAP1、CDKAL1、TYW1[[25], [26], [27]]和ELP3参与tRNA的修饰[[28], [29], [30]]，其中CDKAL1[[31]]和CDK5RAP1[[32]]在tRNA或核糖体蛋白的特定位置进行甲基硫醇化，这些修饰在癌症和其他代谢相关疾病中起着重要作用[[33]]。此外，Viperin（RSAD2）是一种抗病毒免疫蛋白[[34,35]]，它可以抑制多种病毒的复制[[36]]，限制细菌病原体的生长[[37]]，并参与多种细胞功能，包括代谢、信号传导、铁硫簇的形成、脂质筏的扰动以及靶向蛋白质降解[[38]]。
脊椎动物中的RSAD1蛋白具有高度保守的序列。尽管hRSAD1被标记为HemW/RSAD1[[39,40]]，并且被预测为类似HemN的蛋白[[41]]，但它与参与细菌血红素生物合成途径的RS酶的序列相似度较低。例如，hRSAD1与HemN（一种不依赖氧气的共卟啉原氧化酶CPO）的序列相似度为23%，与HemW（被认为具有血红素伴侣功能的蛋白）的相似度为25%[[40,42,43]]。生化和遗传实验表明，hRSAD1不具备CPO活性，并且在系统发育上与HemN类酶相距较远[[40], [41], [42], [43]]。由于RSAD1蛋白是一个具有高度保守序列的独立组，因此在此我们将这类蛋白称为RSAD1而非HemW/RSAD1。
研究表明，RSAD1在胚胎发育、细胞凋亡和其他代谢过程中起着重要作用[[42]]。例如，在斑马鱼中敲低rsad1基因会导致胚胎致死，表现为心脏发育不全、广泛的心包水肿、眼睛发育缺陷以及显著的细胞凋亡增加[[42]]。对成年小鼠rsad1表达的Northern blot分析显示，该蛋白定位于心脏、大脑、肝脏和肾脏组织中[[42]]。研究还表明，rsad1在心脏疾病的小鼠模型中起着关键作用[[44,45]]。此外，在患有镰状细胞贫血的儿童患者中，rsad1表达增加与神经系统疾病（如癫痫、抑郁和学习障碍）有关[[46,47]]。对患有原发性中风的镰状细胞贫血患儿的基因组分析发现，hRSAD1中存在特定突变，这与这些患者中风风险增加相关[[48]]。对患有慢性中心性浆液性脉络膜视网膜病变（CSC）的胎儿进行全外显子测序显示，hRSAD1在这些患者中显著过表达，提示hRSAD1在该疾病的发展中可能起作用[[49]]。对因超声异常导致胎儿死亡或终止妊娠的胎儿进行全外显子测序发现，hrsad1与胎儿水肿、羊水过多、单侧马蹄内翻足、膈疝和胃缺失等缺陷有关，表明其在胎儿发育中具有重要作用[[50]]。有趣的是，hRSAD1与阿尔茨海默病（AD）有关，对AD脑组织的双重标记分析显示，hRSAD1的表达显著高于对照细胞骨架蛋白viniculin，且hRSAD1主要定位于神经元和淀粉样斑块中[[51]]。
在这项工作中，我们展示了hRSAD1的过表达、纯化以及生物物理和生化特性分析。通过光谱技术发现，hRSAD1能与[4Fe-4S]簇结合，并选择性结合原卟啉IX（PPIX）及其金属衍生物（heme(Fe2?)/(Fe3?)和Zn2?PPIX），但不能结合共卟啉或Zn2?八乙基卟啉。此外，hRSAD1还能与heme(Fe2?)结合氧气、一氧化碳和氰化物。我们的研究结果表明，hRSAD1在涉及血红素感知或转运的代谢过程中起着重要作用。
材料
氯化血红素（heme(Fe3?)）、铁原卟啉（heme(Fe2?)（均来自Cayman Chemical，安阿伯，MI，纯度≥90%和96%）、二氯化共卟啉III（CPIII）、锌(II)-共卟啉III四钠盐（ZnCPIII）、锌(II)-原卟啉IX（ZnPPIX）、锌(II)-八乙基卟啉（ZnOEP）（均来自Frontier Specialty Chemicals，洛根，UT，纯度>95%）、原卟啉IX（H?PPIX）（Sigma-Aldrich，圣路易斯，MO，纯度≥95%）以及肉豆蔻酰肉豆蔻酰钠盐（MP Biochemicals）
hRSAD1同源性模型和序列分析
对hRSAD1一级序列的分析显示，它包含三个不同的结构域：N端结构域、自由基SAM（RS）结构域和C端结构域。图2A展示了基于已知的共卟啉原氧化酶HemN（PDB ID: 1OLT）三维结构的hRSAD1的α折叠同源性模型[[60,61]]。RS结构域包含典型的SAM CX?CX?C基序（C代表半胱氨酸，X代表其他氨基酸），该基序用于协调[4Fe-4S]簇，这对催化反应至关重要
讨论
人类自由基SAM蛋白hRSAD1已在E. coli细胞中表达并纯化，以提供关于这种与人类疾病相关且在高等生物中保守的蛋白结构和功能的新见解。纯化的hRSAD1仅在存在洗涤剂（0.01%肉豆蔻酰）的情况下在溶液中保持稳定，其有限的溶解度可能部分归因于预测位于蛋白表面的疏水区域[[S18]]。
结论
我们报告了hRSAD1的表达、纯化及其生物物理和生化特性。我们的发现支持hRSAD1含有氧化还原活性[4Fe-4S]簇这一RS酶的特征，以及一个能够结合金属化或游离态PPIX的特定血红素结合位点。虽然目前的研究还不能确定hRSAD1的具体生物学功能，但我们的结果提出了几种可能性。
CRediT作者贡献声明
Oleg A. Zadvornyy：撰写 – 审稿与编辑、初稿撰写、可视化、方法学研究、数据分析、概念构建。
Mikhail Drobizhev：撰写 – 审稿与编辑、监督、方法学研究、资金获取、数据分析、概念构建。
Monika Tokmina-Lukaszewska：撰写 – 审稿与编辑、研究、数据分析。
Eric M. Shepard：撰写 – 审稿与编辑、研究。
William E. Broderick：撰写 – 审稿与编辑。
作者声明他们没有已知的利益冲突或个人关系可能影响本文所述的研究。
本研究得到了美国国立卫生研究院下属的国家普通医学科学研究所（R35 GM131889资助给J.B.B.）和美国国立卫生研究院下属的国家神经疾病与中风研究所（U24 NS109107资助给M.D.）的支持。蒙大拿州立大学的蛋白质组学、代谢组学和质谱设施的资金由MJ Murdock慈善信托基金和NIH（P20 GM103474）提供。内容仅代表作者本人观点。
