热休克反应驱动的生物学特征与DNAJB11在肝细胞癌（HCC）中的作用：其在预后、免疫微环境、铁死亡（ferroptosis）及治疗敏感性方面的多方面影响

肝细胞癌中热休克反应（HSR）通过37个关键基因（HRGs）聚类分为C1和C2亚群，C1化疗敏感，C2免疫治疗响应强，核心HRGs包括CD4、CDK5、CDKN2A、DNAJB11、HBB和TRPV4，构建的风险模型经IHC、单细胞测序和空间转录组验证，DNAJB11敲低抑制细胞增殖和转移，并关联到ferroptosis通路。

　　

耿文汉|李天天|张敬琳|沈木正|张金瑞|李敬翰|马晓杰|陈健|孙浩金|刘晓鹏|曹鹏秀|范玉梅|谭柯

河北省细胞生物学基础学科研究中心分子与细胞生物学重点实验室，河北省生态环境协同创新中心，河北师范大学生命科学学院动物生理学、生物化学与分子生物学重点实验室，中国石家庄

摘要

热休克反应（HSR）是一种保守的细胞机制，通过诱导热休克蛋白（HSPs）来保护细胞免受各种应激因素的损害。然而，迄今为止，尚未有研究利用HSR开发出用于预测肝细胞癌（HCC）患者预后并指导治疗策略的预测风险模型。在本研究中，我们根据37个关键HSR相关基因（HRGs）的表达情况，确定了HCC患者的两个不同分子亚组。这些亚组在免疫浸润、药物反应性和免疫治疗效果方面存在显著差异。值得注意的是，C1亚组的患者对化疗更敏感，而C2亚组的患者对免疫疗法更敏感。通过机器学习算法，我们确定了6个核心HRGs（CD4、CDK5、CDKN2A、DNAJB11、HBB和TRPV4）作为潜在的生物标志物。我们开发了一个包含这些HRGs的风险评分模型来预测HCC的预后。使用免疫组化（IHC）、单细胞RNA测序和空间转录组学验证了这些HRGs的表达情况。重要的是，核心HRGs与铁死亡（ferroptosis）显著相关，且RSL3处理显著影响了HCC细胞中这些HRGs的表达水平。此外，敲低DNAJB11显著抑制了细胞生长，抑制了迁移和侵袭能力，并破坏了线粒体完整性。本研究首次全面分析了HCC中的HSR，提供了一种新的分子分类和预测工具，以指导个性化治疗策略。

引言

热休克反应（HSR）是一种高度保守且至关重要的细胞机制，可保护生物体免受各种应激条件的影响，包括热、氧化应激和其他环境压力（Akerfelt, Morimoto, & Sistonen, 2010; Dea & Pincus, 2024; Gomez-Pastor, Burchfiel, & Thiele, 2018）。它是一种保护性反应，通过快速诱导一组称为热休克蛋白（HSPs）的蛋白质的表达来维持细胞稳态（Anckar & Sistonen, 2011; Kmiecik & Mayer, 2022）。HSPs是分子伴侣蛋白，有助于蛋白质的正确折叠，防止错误折叠的蛋白质聚集，并促进变性蛋白质的重新折叠，因此在细胞保护和从应激中恢复中发挥关键作用（Alimardan et al., 2023; Kampinga & Bergink, 2016）。HSR的调控主要涉及热休克因子（HSFs）的激活，特别是HSF1，它是真核生物中该反应的主要调节因子（Akerfelt et al., 2010; Anckar & Sistonen, 2011; G. Wang, Cao, Fan, & Tan, 2020; B. Zhang, Fan, Cao, & Tan, 2021）。在基础条件下，HSP90在一个动态的多伴侣复合体中组装，通过与HSF1直接结合而发挥分子夹具的作用。这种相互作用将HSF1隔离在无活性和单体状态，从而抑制其三聚化和DNA结合能力。在应激诱导的HSF1激活后，HSP70和HSP40的表达上调，形成了一个强大的负反馈循环。这些诱导的伴侣蛋白协调活性HSF1三聚体的解体，促进其单体化，并有助于抑制性HSP90复合体的重组。这一机制确保了HSR的精确终止和蛋白质稳态的恢复（Akerfelt et al., 2010; Anckar & Sistonen, 2011; G. Wang et al., 2020; B. Zhang et al., 2021）。

理解HSR在健康和疾病中都具有重要的意义（Akerfelt et al., 2010; Anckar & Sistonen, 2011; Neef, Jaeger, & Thiele, 2011）。在正常细胞中，HSPs有助于维持蛋白质稳态，防止受损蛋白质的聚集，并促进细胞成分的修复（Kunachowicz et al., 2024; Singh et al., 2024）。然而，在癌细胞中，HSR可能被利用来促进致癌和癌症进展。例如，癌细胞通常具有上调的HSR，使它们能够更好地耐受肿瘤内的应激条件，如缺氧、营养缺乏和高水平的活性氧（ROS）。这种增强的耐受性有助于癌细胞的存活和增殖。HSPs可以促进参与细胞运动和侵袭的蛋白质的折叠，从而增强癌细胞的转移潜力（Dai, Whitesell, Rogers, & Lindquist, 2007; Mendillo et al., 2012; Tang et al., 2015; Whitesell & Lindquist, 2009）。一些HSPs已知可以伴侣癌基因蛋白，这些蛋白在癌细胞中经常发生突变或过表达。通过稳定这些癌蛋白，HSPs有助于维持它们的功能并促进癌细胞的存活（Chiosis, Digwal, Trepel, & Neckers, 2023; Liang, Chen, Wang, Wang, & Zhang, 2024; Wei et al., 2024）。总体而言，HSR和HSPs深度参与致癌过程，在癌细胞存活、治疗抵抗性和免疫反应中发挥作用（Akerfelt et al., 2010; Anckar & Sistonen, 2011; Hockemeyer et al., 2024; G. Wang et al., 2020）。

肝细胞癌（HCC）的发病机制和进展受到多种因素的复杂相互作用的影响，包括肝脏再生、癌干细胞特性、肝细胞可塑性和代谢途径调节（Chen et al., 2025; Chen et al., 2024; Llovet et al., 2021; Ning et al., 2023）。深入理解HSR与HCC之间的相互作用可能有助于识别新的诊断生物标志物并开发创新的治疗策略。在本研究中，我们采用了强大的生物信息学策略，并结合机器学习算法，阐明了HCC中HSR的表达谱、预后意义和分子亚型。最初，我们实施了共识聚类分析，根据37个关键HSR相关基因（HRGs）的表达模式将患者划分为两个不同的分子亚组（C1和C2）。后续分析显示，这两个亚组在免疫浸润、信号通路、药物反应性和免疫治疗效果方面存在显著差异。值得注意的是，C1亚组的HCC患者对化疗更敏感，而C2亚组的患者似乎更易受到免疫疗法的影响。此外，通过最小绝对收缩（LASSO）和随机森林（RF）回归技术，我们确定了6个核心HRGs（CD4、CDK5、CDKN2A、DNAJB11、HBB和TRPV4）。更重要的是，我们构建了一个包含这六个HRGs的HCC患者风险评分模型，利用COX分析来揭示HRGs在HCC中的预后潜力。这些关键HRGs的表达通过免疫组化（IHC）染色、单细胞RNA测序和空间转录组学分析得到了证实。值得注意的是，四个HRGs的表达水平与RSL3（经典的铁死亡诱导剂）显著相关。RSL3处理降低了HepG2和Huh7细胞系中CD4和HBB的表达，并上调了CDK5、CDKN2A和DNAJB11的表达。更重要的是，敲低DNAJB11显著抑制了细胞增殖，表现为细胞活力和菌落形成的减少。功能测定显示，迁移和侵袭能力显著受到抑制，表明DNAJB11在调节转移潜力中起着关键作用。值得注意的是，DNAJB11耗尽后，线粒体完整性严重受损。

据我们所知，这项研究首次探讨了基于HRG表达的共识聚类方法、预后效用、免疫微环境动态和治疗敏感性在HCC中的应用。HSR相关的分子分类和预后生物标志物特征为完善HCC患者的预后评估和个性化治疗策略提供了新的工具，符合预测性、预防性和个性化医学的原则。

数据获取与处理

数据获取和预处理遵循标准的生物信息学协议。HCC患者和正常样本的转录组数据及相应的临床信息从癌症基因组图谱（TCGA）数据库和国际癌症基因组联盟（ICGC）数据库中获取。我们从TCGA数据库下载了STAR对齐的RNA-seq数据及其对应的临床信息（//portal.gdc.cancer.gov

识别HCC中差异表达的HRGs

为了识别HCC和正常样本之间的差异表达基因（DEGs），我们使用TCGA数据库进行了差异表达分析。共获得了2897个DEGs（2451个上调DEGs和446个下调DEGs），阈值设为|log₂(FC)|>?1且调整后的p值

讨论

HSR是一种复杂且高度保守的细胞机制，使生物体能够应对热应激。虽然HSR在正常细胞中通常具有保护作用，但在癌细胞中其失调会促进致癌和肿瘤进展（Akerfelt et al., 2010; Gomez-Pastor et al., 2018; G. Wang et al., 2020）。癌细胞由于蛋白质合成增加、代谢紊乱和ROS的产生而经常经历内部蛋白毒性应激。

CRediT作者贡献声明

李敬翰：可视化、方法学、正式分析、数据管理。张金瑞：正式分析、数据管理。陈健：正式分析、数据管理。马晓杰：正式分析、数据管理。刘晓鹏：正式分析、数据管理。孙浩金：正式分析、数据管理。范玉梅：写作——审稿与编辑、写作——初稿、概念化。耿文汉：可视化、方法学、正式分析、数据管理。曹鹏秀：写作——审稿与编辑，

未引用参考文献

Zhang et al., 2024.

资助

本研究得到了中央政府支持地方科学技术发展的指导资金（236Z3003G）、河北省高等教育科学研究专项任务项目（JZX2024020）、河北省中医药管理局（2023072）、河北师范大学重点发展基金（L2024ZD16）、河北师范大学跨学科研究基金（L2024J04）以及大学生创新创业培训计划的支持

利益冲突声明

作者声明没有利益冲突。