芥末精油对荧光假单胞菌和腐败希瓦氏菌的抗菌活性与作用机制研究

《LWT》：Antibacterial activity and mechanism of mustard essential oil against Pseudomonas fluorescens and Shewanella putrefaciens

为解决冷藏水产品中优势腐败菌（荧光假单胞菌和腐败希瓦氏菌）污染导致的品质劣变问题，研究人员系统探究了芥末精油（MEO）的抗菌活性与多维度作用机制。结果表明，MEO通过破坏细胞膜完整性、干扰能量代谢（TCA循环）及氨基酸代谢通路，并靶向抑制关键酶活性，显著抑制两种细菌的生长。该研究为MEO作为天然抗菌剂在水产品保鲜中的精准应用提供了理论依据。

　　

水产品因其高营养、高水分的特点，在冷链流通过程中极易成为微生物滋生的“温床”。尤其是冷藏环境下，荧光假单胞菌（Pseudomonas fluorescens）和腐败希瓦氏菌（Shewanella putrefaciens）这类嗜冷革兰氏阴性腐败菌会成为优势菌群。它们就像水产品中的“腐败工程师”，通过分泌复杂的酶系降解肌肉蛋白和脂肪，产生具有鱼腥味的挥发性硫化物和生物胺，不仅导致产品感官品质急剧下降，还带来潜在的食品安全风险。传统的化学防腐剂虽然有效，但面临监管限制和消费者对化学残留的担忧。因此，寻找安全、高效、多靶点的天然保鲜替代品成为研究热点。植物精油因其天然来源和广谱抗菌活性备受关注。芥末精油（Mustard Essential Oil, MEO）主要成分为异硫氰酸烯丙酯（Allyl Isothiocyanate, AITC），此前研究多关注其对常温常见致病菌的作用，但其对冷藏环境下嗜冷腐败菌独特的代谢干扰机制和具体分子靶点尚不明确，限制了其在高端冷链中的精准应用。发表在《LWT》上的这项研究，正是为了系统揭示MEO抑制这两种水产品关键腐败菌的“立体化”作用机制。

为了全面解析MEO的抗菌机制，研究人员构建了一个从表型到代谢再到分子的多维验证体系。关键技术方法包括：1) 抗菌活性测定：采用琼脂纸片扩散法测定抑菌圈直径（IZD），肉汤稀释法测定最低抑菌浓度（MIC）和最低杀菌浓度（MBC），并绘制生长曲线。2) 细胞结构完整性分析：使用扫描电子显微镜（SEM）观察细胞形态变化，测定碱性磷酸酶（AKPase）和Na⁺/K⁺-ATP酶活性、电导率以及细胞内核酸和蛋白质的泄漏情况。3) 代谢组学分析：运用超高效液相色谱-线性离子阱高分辨质谱联用技术（UPLC-LTQ-Orbitrap-MS）对经MEO处理的细菌进行非靶向代谢组学分析，结合多元统计方法筛选差异代谢物，并通过KEGG数据库进行通路富集分析。4) 分子对接模拟：以AITC为配体，以差异代谢物相关通路中的关键酶（如TCA循环和氨基酸代谢中的酶）为受体，利用AutoDock软件进行分子对接，验证MEO与靶酶的结合能力。

研究结果

3.1. 抗菌活性

MEO对两种细菌均表现出显著的浓度依赖性抑制效果。通过抑菌圈、MIC/MBC测定和生长曲线分析发现，MEO对荧光假单胞菌的抑制作用更强（MIC为0.025 mg/mL），且在高浓度（MIC和2MIC）下能完全抑制细菌生长24小时。

3.2. 细菌细胞结构完整性测定

3.2.1. 细胞形态变化

SEM观察显示，经MEO处理后，细菌细胞出现严重的表面皱缩、结构破裂和塌陷。高浓度（2MIC）处理导致细胞质大量泄漏并聚集成团，表明细胞膜完整性遭到严重破坏。

3.2.2. AKPase和ATP酶活性

MEO处理导致细胞膜相关酶活性发生显著变化。AKPase活性呈时间依赖性增加，表明膜通透性增强；而Na⁺/K⁺-ATP酶活性则被强烈抑制，尤其在2MIC浓度下几乎完全失活，说明MEO破坏了细胞的离子泵功能和能量代谢。

3.2.3. 电导率

MEO处理显著提高了菌悬液的电导率，且浓度越高、时间越长，电导率增加越明显。这表明细胞膜受损，导致细胞内K⁺、Ca²⁺等电解质大量外泄。荧光假单胞菌的电导率变化比腐败希瓦氏菌更为剧烈，表明其细胞膜对MEO更敏感。

3.2.4. 细胞内容物泄漏

MEO处理导致细胞外核酸和蛋白质含量显著增加，且呈剂量依赖性。这进一步证实了MEO破坏了细胞膜的屏障功能，导致细胞内大分子物质泄漏。

3.3. 代谢组学分析

3.3.1. 多元统计分析

主成分分析（PCA）和正交偏最小二乘判别分析（OPLS-DA）显示，MEO处理组与对照组代谢物谱明显分离，表明MEO引起了细菌细胞内代谢的广泛重编程。

3.3.2. 差异代谢物聚类与KEGG富集分析

共筛选出大量显著差异代谢物（SDMs）。KEGG通路富集分析表明，这些代谢物主要富集在氨基酸代谢、能量代谢（三羧酸循环TCA cycle和糖酵解）以及核苷酸代谢等通路上。

3.3.3. 代谢通路分析

具体而言，TCA循环中的关键中间体（如柠檬酸、琥珀酸、L-苹果酸）和糖酵解/丙酮酸代谢相关物质显著下调，表明中心能量代谢受到严重抑制。同时，多种氨基酸（如天冬氨酸、N-乙酰-L-谷氨酸）含量下降，表明蛋白质合成和氮代谢受阻。这些代谢紊乱从分子层面解释了细菌生长停滞和能量衰竭的原因。

3.4. 分子对接

以AITC为配体，对代谢组学发现的差异通路中的关键酶进行分子对接模拟。结果显示，AITC与TCA循环中的延胡索酸水合酶、磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶、乌头酸脱羧酶，以及氨基酸代谢中的天冬氨酸激酶、阿魏酸脱羧酶、精氨酸琥珀酸合酶等均存在一定的结合能力，结合能范围在-3.2至-4.1 kcal/mol之间。这从分子水平上初步验证了MEO通过靶向这些关键代谢酶来发挥抗菌作用的可能性。

结论与意义

本研究系统阐明了芥末精油（MEO）对水产品关键腐败菌荧光假单胞菌和腐败希瓦氏菌的多层次抗菌机制。MEO通过其疏水性和活性基团破坏细菌细胞膜结构，导致膜通透性增加、电解质泄漏、内容物外流以及膜结合酶（如Na⁺/K⁺-ATP酶）功能丧失。更深层次上，MEO引起细菌代谢网络的广泛重编程，特别是显著抑制了三羧酸（TCA）循环和氨基酸代谢等核心能量与物质合成通路。分子对接模拟进一步支持了其活性成分AITC与关键代谢酶存在相互作用。该研究首次构建了从表型破坏到代谢干扰再到分子识别的完整证据链，不仅填补了MEO抑制嗜冷腐败菌机制的理论空白，也为开发基于MEO的活性包装和智能保鲜系统，延长冷藏肉制品和水产品的货架期品质，提供了关键的理论依据和新的思路。未来研究可着眼于优化MEO在食品体系中的递送方式，以平衡其强效抗菌活性与对食品感官品质的影响。