《LWT》：Optimization of the solvent free microwave assisted extraction of
Cinnamomum jensenianum essential oil and evaluation of its antifungal activity against
Fusarium sporotrichioides and
Fusarium avenaceum
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为解决化学杀菌剂抗性及环境毒性问题，研究团队开展了一项关于利用无溶剂微波萃取技术优化产黄酮樟叶精油及其对抗马铃薯干腐病菌活性的研究。他们成功优化了萃取工艺，获得了高产率且化学成分与传统方法无显著差异的精油，并证实该精油对尖孢镰刀菌和燕麦镰刀菌具有显著的抑制效果，最小抑制浓度均为1.0 g/L。该研究表明产黄酮樟精油有潜力作为一种绿色环保的天然抗真菌剂用于作物保护，为开发可持续农业病害防控方案提供了新的思路。
马铃薯，这种全球第四大粮食作物，是我们餐桌上常见的美味。然而，它们在收获后的储存过程中却面临着一个棘手的敌人——干腐病。这种由多种镰刀菌（Fusarium spp.）引起的真菌病害，不仅每年造成高达6%至25%的产量损失（严重时可达60%），还会损害马铃薯的营养和感官品质，给全球经济带来重大负面影响。目前，控制马铃薯干腐病主要依赖化学杀菌剂（如噻苯咪唑、氟硅唑等），但长期使用不仅导致了耐药性镰刀菌的出现，更对人类健康和环境构成了潜在的毒理学风险。更糟糕的是，镰刀菌在侵染过程中还会产生多种有毒的次级代谢产物——真菌毒素（Mycotoxins），这些毒素对植物、特别是对人类和动物具有毒性，可能引发致癌、致畸、免疫抑制等一系列不良反应。因此，寻找安全、有效且环境友好的替代防控策略，成为了一项紧迫的任务。
正是在这样的背景下，植物来源的精油因其天然、环保以及对多种真菌展现出良好抑制效果的特性，受到了研究者的广泛关注。其中，产黄霜樟（Cinnamomum jensenianum）作为一种主要分布于中国江西、湖北等地的樟科植物，其精油（CJEO）已被报道具有抗氧化和抗菌活性。然而，其对于引起马铃薯干腐病的关键镰刀菌的抑制作用尚不明确。与此同时，传统的精油萃取方法，如水蒸气蒸馏法，虽然应用广泛，但存在耗时耗能、效率低下等缺点。而新兴的无溶剂微波萃取技术则展现出高效、节能的优势。为了探索一种更优的提取方法并获得具有潜在抗真菌活性的天然产物，来自江西师范大学生命科学学院的研究团队在《LWT》上发表了一项研究，他们系统地优化了从产黄霜樟叶片中萃取精油的无溶剂微波萃取工艺，并深入评估了所得精油对两种关键病原菌——尖孢镰刀菌（Fusarium sporotrichioides）和燕麦镰刀菌（Fusarium avenaceum）的抗真菌活性。
关键技术方法概述
本研究采用了多种关键技术方法：首先，使用无溶剂微波萃取法和传统水蒸气蒸馏法分别提取产黄霜樟叶精油（CJEO）。其次，采用响应面方法中的Box-Behnken设计（BBD）来系统优化SFME的萃取工艺参数（水分含量、微波功率和微波时间）。接着，利用气相色谱-质谱联用技术（GC-MS）对两种方法提取的精油化学成分进行定性和定量分析。最后，通过体外实验评估CJEO的抗真菌活性，包括菌丝生长抑制实验（在PDA培养基上进行）和孢子萌发抑制实验（在PDB液体培养基中进行），并以广谱抗真菌药克霉唑作为阳性对照。
研究结果
3.1. 单因素实验
研究首先通过单因素实验考察了微波时间、微波功率和原料水分含量对CJEO得率的影响。
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3.1.1. 微波时间的影响：实验发现CJEO得率随微波时间（10至30分钟）延长而增加，在30分钟时达到近似萃取平衡。过长的微波时间可能导致原料糊化、能量浪费以及含氧化合物的热降解。因此，选择15-25分钟作为后续实验范围。
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3.1.2. 微波功率的影响：随着微波功率从120 W增加到700 W，CJEO得率先增后减，在540 W时达到峰值。较高功率能加速升温促进挥发，但功率过高会导致局部热解，影响精油质量。研究选取230-540 W作为后续范围。
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3.1.3. 水分含量的影响：在固定其他条件下，CJEO得率随水分含量增加呈现先升后降的趋势，在50 g/hg时达到最高。水分过低可能导致蒸发不足，过高则可能引起某些挥发物的水解，影响提取。因此，选取40-60 g/hg作为优化范围。
3.2. 响应面分析
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3.2.1. 响应面试验结果与方差分析：采用BBD设计17组实验，建立了以CJEO得率为响应值的二次多项式模型。方差分析表明模型极显著，且拟合度良好。各因素对得率的影响程度依次为：微波功率 > 微波时间 > 水分含量。
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3.2.2. 响应面分析：通过三维响应面图分析了各因素间的交互作用。结果表明，微波功率对得率有显著的线性正效应，而水分含量和微波时间则表现出抛物线效应，即存在最优值。
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3.2.3. 模型充分性：通过正态概率图和预测值与实际值的比较图验证了模型的准确性和预测可靠性。
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3.2.4. 方法验证：根据模型预测，最佳工艺条件为水分含量49 g/hg、微波功率527 W、微波时间21 min。为便于操作，调整为水分含量50 g/hg、微波功率530 W、微波时间21 min进行验证。三次平行实验的实际平均得率为3.91 ± 0.14 mg/g，与预测值（3.78 mg/g）接近，证明了模型的可靠性。
3.3. 萃取动力学
研究比较了SFME和HD的萃取动力学曲线和温度变化曲线。结果显示，SFME能在5分钟内使体系温度达到水的沸点（100°C），而HD需要超过30分钟。SFME在大约30分钟内完成精油萃取，而HD需要超过4小时才能达到平衡。此外，SFME获得的CJEO得率显著高于HD，且能耗（6.68 × 105J）远低于HD（1.44 × 107J）。这些数据表明，SFME具有更高的萃取效率、更低的能耗和更短的处理时间。
3.4. 精油样品的组成
通过GC-MS分析，在SFME提取的CJEO中鉴定出44种化合物，在HD提取的CJEO中鉴定出42种化合物，二者总峰面积百分比分别为96.88%和96.24%。两种方法提取的精油主要成分一致，没有显著差异。主要挥发物包括：endo-樟脑醇（17.44% vs. 18.02%）、α-柠檬醛（15.95% vs. 13.51%）、β-水芹烯（13.46% vs. 12.79%）、芳樟醇（11.55% vs. 12.56%）和(S)-cis-马鞭草烯醇（11.82% vs. 10.05%）。这些化合物分属于萜类、醇类和醛类，均被认为具有显著的抗菌活性。与HD相比，SFME额外提取出了异胡薄荷醇、依兰烯等几种化合物，且含氧化合物比例相当（SFME 72.92%，HD 73.89%）。
3.5. 体外抗真菌活性
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菌丝生长抑制：CJEO对尖孢镰刀菌和燕麦镰刀菌的菌丝生长表现出浓度依赖性的抑制作用。随着CJEO浓度（0.2-1.0 g/L）增加，菌落直径减小。浓度为0.8 g/L的CJEO抑制效果与阳性对照克霉唑相当。当浓度达到1.0 g/L时，对两种菌的抑制率均达到100%，因此确定CJEO对两种镰刀菌的最小抑制浓度（MIC）均为1.0 g/L。
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孢子萌发抑制：在PDB液体培养基中，考察了不同浓度CJEO（1/2 MIC, 1 MIC, 2 MIC）对孢子萌发的影响。对于两种镰刀菌，1/2 MIC的处理初期有一定抑制，但后期孢子可能恢复生长；1 MIC的处理能将抑制率维持在接近90%；而2 MIC的处理则能完全抑制孢子的萌发，展现出快速杀菌效果。
研究结论与重要意义
本研究成功运用响应面法优化了产黄霜樟叶精油的无溶剂微波萃取工艺，确定了最佳条件为水分含量50 g/hg、微波功率530 W、微波时间21分钟，在此条件下实际得率达3.91 ± 0.14 mg/g。该工艺相比传统水蒸气蒸馏法，显著缩短了萃取时间（从>4小时降至约30分钟），大幅降低了能耗，是一种高效、节能、环保的提取方法。化学成分分析表明，SFME法提取的CJEO与HD法提取的油在主要成分上无显著差异，主要包含endo-樟脑醇、α-柠檬醛、β-水芹烯、芳樟醇和(S)-cis-马鞭草烯醇等活性成分。
尤为重要的是，体外抗真菌实验证实，CJEO对引起马铃薯干腐病的关键病原菌——尖孢镰刀菌和燕麦镰刀菌均具有显著的抑制效果，其最小抑制浓度（MIC）为1.0 g/L，且在2 MIC浓度下能快速完全抑制孢子萌发。其抑菌机制可能归因于其主要活性成分（如endo-樟脑醇、α-柠檬醛、芳樟醇等）通过破坏真菌细胞壁和细胞膜、改变细胞通透性、导致内容物泄露以及干扰细胞代谢和氧化还原平衡等多重途径发挥作用。
综上所述，这项研究不仅为产黄霜樟精油的高效绿色提取提供了优化方案，更重要的是首次系统评估并证实了该精油对两种重要镰刀菌病原体的强烈抑制作用。这为开发一种基于植物精油的、可替代部分化学杀菌剂的天然抗真菌剂提供了有力的实验依据，对于推动农作物病害的绿色防控、保障食品安全和农业可持续发展具有积极的潜在意义。当然，后续研究仍需关注CJEO的热稳定性和储存稳定性、其体内抗真菌活性、详细的作用机制、潜在毒性，以及在实际控制马铃薯干腐病中的应用效果评价。
