《Molecular Nutrition & Food Research》：Caloric Restriction and Dietary Taurine Regulate Taurine Homeostasis Through Distinct Tissue-Specific Mechanisms in Mice
引言
牛磺酸是一种游离氨基酸，哺乳动物通过膳食摄取和生物合成获得。它在肉类、鱼类、海鲜、乳制品和能量饮料中含量丰富。摄入后，牛磺酸通过牛磺酸转运蛋白Slc6a6被肠道上皮细胞吸收并转运至靶组织。其生物合成主要在肝脏、大脑和肾脏进行，以甲硫氨酸和半胱氨酸为底物。牛磺酸在肠道、肾脏、肝脏和胆汁中含量极高，并作为胆汁酸的结合物存在。胆汁酸是胆固醇衍生物，在肝脏中合成，并由限速酶胆固醇7α-羟化酶（CYP7A1）启动。核受体小异二聚体伴侣（SHP）可抑制Cyp7a1表达。胆汁酸生成后，与牛磺酸或甘氨酸结合，在小鼠中约95%与牛磺酸结合，而在人类中约70%与甘氨酸结合。结合反应由胆汁酸CoA连接酶（BAL）和胆汁酸CoA:氨基酸N-酰基转移酶（BAT）催化。
热量限制（CR）是一种已知能延长健康寿命和寿命的干预措施。先前研究表明，CR能增加小鼠肝脏胆汁酸合成、结合及向胃肠道的释放。胆汁酸分泌到肠道后，被微生物胆汁盐水解酶（BSH）修饰，导致解离的胆汁酸和游离牛磺酸释放。大部分胆汁酸被进一步代谢为次级胆汁酸，被吸收并再循环至肝脏。CR动物的肠道显示出增强的胆汁酸吸收能力，从而减少了胆汁酸随粪便的流失。
解离释放的牛磺酸可与多种分子形成偶联物。目前已知的包括氯牛磺酸和牛磺酸-谷胱甘肽（GSH）。牛磺酸-GSH的出现伴随着谷胱甘肽S-转移酶（GST）表达和活性的升高。GSTs是一个酶家族，催化GSH与不同亲电子底物的结合。生成的水溶性偶联物进一步通过尿液和胆汁排出。研究发现，牛磺酸-GSH偶联物支持CR动物从肠道吸收牛磺酸，导致CR小鼠粪便中牛磺酸分泌水平低于自由采食对照组。吸收的牛磺酸随后在体内分布，CR影响其向肾脏、心脏、脾脏和脂肪组织等多个器官的摄取。在脂肪组织中，牛磺酸通过刺激β-氧化促进CR触发的脂肪组织减少。
CR期间的牛磺酸稳态是一个了解甚少的机制，可能有助于CR对健康寿命和寿命延长的有益影响。先前研究已证实，CR通过增强胆汁酸合成、解离及随后的牛磺酸-谷胱甘肽偶联物形成，增加肠道黏膜中的牛磺酸水平。然而，膳食牛磺酸对此CR诱导表型的具体贡献尚不清楚。
鉴于膳食牛磺酸补充和CR具有重叠的益处，包括改善线粒体功能、减少氧化应激、抗炎作用、改善心血管和神经系统健康、支持体重减轻和糖尿病治疗以及延长寿命的特性，本研究假设膳食牛磺酸调节可能增强或破坏CR诱导的牛磺酸稳态变化。具体假设为：（1）膳食牛磺酸补充将增强CR诱导的牛磺酸浓度和相关代谢标志物的变化；（2）限制膳食牛磺酸及其前体（半胱氨酸和甲硫氨酸）将减弱CR诱导的牛磺酸水平升高和相关酶活性。
实验部分
使用雄性C57Bl/6小鼠进行研究。小鼠被随机分为自由采食对照组或CR组。CR组小鼠每天饲喂指定量的饲料，约为其自由采食摄入量的80%，持续14天。为限制膳食牛磺酸摄入，自由采食和CR组给予低牛磺酸饮食（LTD）或等热量匹配对照饮食。在第二个实验中，动物饲喂标准饮食，其中一半的自由采食和CR组在饮用水中添加5%牛磺酸。所有动物在解剖前禁食2小时，收集肝脏、回肠黏膜、血浆和粪便样本并冷冻保存。
使用液相色谱-质谱联用技术检测GSH、牛磺酸及其偶联物。胆汁酸检测采用已报道的方法。GST活性使用商业检测试剂盒测定。基因表达分析通过qRT-PCR进行。统计采用双因素方差分析及Bonferroni校正。
结果
为挑战CR相关的肠道牛磺酸水平升高，对自由采食和CR动物施加低牛磺酸饮食（LTD）。与先前研究一致，CR增加了回肠黏膜中的牛磺酸浓度。LTD饮食对肠道黏膜牛磺酸浓度的影响极小或可忽略不计。然而，与自由采食组相比，自由采食LTD组中牛磺酸-GSH偶联物水平降低。相应地，自由采食LTD组中一种GST（Mgst1）的mRNA表达降低，且CR LTD组的GST酶活性较CR组降低。
除了牛磺酸-GSH，还测量了回肠黏膜中其他牛磺酸偶联物的水平。CR和CR LTD组均显示几种偶联物水平升高，且CR LTD与自由采食LTD的比较表明，LTD并未抵消CR引发的牛磺酸偶联物水平升高。LTD组与相应标准饲料组之间存在差异趋势，但无统计学显著性。
接下来评估了LTD对肝脏的影响。肝脏重量受CR和LTD影响，CR和自由采食LTD小鼠的肝脏重量低于自由采食动物。当考虑体重差异时，自由采食LTD和CR LTD动物的肝脏相对于相应的对照组更轻。与先前发现一致，CR不影响肝脏牛磺酸或牛磺酸-GSH水平。然而，与相应的标准饲料对照组相比，自由采食LTD和CR LTD的牛磺酸浓度均降低。而牛磺酸-GSH水平或肝脏中GST转移酶的活性不受CR或LTD影响。
与牛磺酸浓度变化相对应，LTD小鼠肝脏中多种牛磺酸偶联物水平较相应对照组降低。
在血浆中，自由采食LTD组的牛磺酸浓度较自由采食组降低。两个CR组均显示牛磺酸浓度较相应的自由采食组升高。关于牛磺酸偶联物，自由采食LTD组中有两种偶联物水平较自由采食组降低，而CR LTD组中较自由采食LTD组升高。比较CR和CR LTD动物，牛磺酸偶联物水平无统计学显著差异。
在先前报告中，CR降低了粪便中的牛磺酸浓度。在当前数据集中，由于CR组变异性高，差异无统计学显著性。关于牛磺酸偶联物，自由采食LTD组中有四种较自由采食组显著下调，一种在自由采食LTD组中较CR LTD组减少。
为进一步挑战CR诱导的肠道牛磺酸和牛磺酸偶联物增加，给自由采食和CR小鼠饮用含5%牛磺酸的水。牛磺酸补充中和了自由采食组和CR组之间通常存在的回肠黏膜牛磺酸浓度差异。具体而言，该干预将自由采食牛磺酸组的牛磺酸水平提高到与CR组相当的水平，但未导致任何统计学显著变化。
回肠黏膜中牛磺酸-GSH偶联物水平的变化模式与该组织中牛磺酸浓度的模式相似，与LTD情况类似。牛磺酸-GSH水平在CR组高于自由采食组，而牛磺酸补充干扰了这种模式。牛磺酸摄入提高了自由采食组的牛磺酸-GSH水平，但未进一步增加CR牛磺酸组的水平。值得注意的是，Mgst1的mRNA表达模式与牛磺酸-GSH水平不重叠，但受CR调节。为澄清此差异，评估了GSTs活性。补充牛磺酸增加了自由采食牛磺酸组和CR牛磺酸组的GST活性，且与牛磺酸-GSH水平的相关性比GSTs mRNA表达模式更密切，这意味着GST活性和牛磺酸-GSH水平受牛磺酸水平调节，而基因表达更受CR影响。
CR导致回肠黏膜中少数牛磺酸偶联物水平较自由采食组升高。补充牛磺酸倾向于增加牛磺酸偶联物水平；然而，仅有一种偶联物在CR牛磺酸组与CR组相比有统计学显著影响。
牛磺酸转运蛋白Slc6a6的表达在牛磺酸动物的回肠中保持了自由采食-CR模式，表明CR对基因表达的影响强于牛磺酸补充。
接下来，牛磺酸补充增加了自由采食牛磺酸组相对于自由采食组的肝脏重量，但降低了CR牛磺酸组相对于CR组的肝脏重量。
肝脏牛磺酸浓度受牛磺酸补充的影响强于肠道浓度。牛磺酸-GSH水平紧随牛磺酸浓度的变化，尽管GSTs活性未受影响，与LTD动物肝脏中观察到的相似。
与对照组相比，自由采食牛磺酸组和CR牛磺酸组肝脏中牛磺酸偶联物水平显著升高。相反，在对照组和牛磺酸条件下，自由采食组和CR组肝脏的牛磺酸偶联物水平无差异，与先前报告一致。
关于肝脏胆汁酸，牛磺胆酸（TCA）浓度在自由采食牛磺酸组相较于自由采食组增加。牛磺熊去氧胆酸（TUDCA）也呈现类似趋势。对应于某些胆汁酸水平的轻微增加，Cyp7a1基因的mRNA表达在自由采食牛磺酸组高于自由采食组。而牛磺酸补充不影响Shp基因表达。最后，参与牛磺酸生物合成和结合的基因Cdo和Bal受膳食牛磺酸的适度影响。在CR牛磺酸组与CR组相比，Cdo mRNA水平降低，但不足以中和自由采食组与CR组之间Cdo表达的差异。对于Bal，基因表达在自由采食牛磺酸组高于自由采食组，且牛磺酸添加减小了自由采食组与CR组之间的差异。
与肝脏类似，补充牛磺酸提高了自由采食牛磺酸组和CR牛磺酸组血浆中游离牛磺酸及多种牛磺酸偶联物的水平。
在粪便中，自由采食牛磺酸组和CR牛磺酸组均显示牛磺酸及其偶联物浓度较相应对照组增加。然而，自由采食牛磺酸组的水平显著高于任何组别，这意味着先前描述的CR动物牛磺酸吸收效率增强在牛磺酸过剩期间也得以维持，而自由采食动物则通过粪便排出过量牛磺酸。
讨论
本研究试图通过给予限制牛磺酸的饮食或提供牛磺酸补充，来挑战与肠道牛磺酸及其偶联物水平增加相关的CR特征。限制或补充牛磺酸对肝脏和血浆牛磺酸水平的影响大于对肠道牛磺酸水平的影响。肠道中GSTs的表达似乎更受CR影响，而GST活性与牛磺酸-GSH水平更密切相关。然而，在肝脏中，接受牛磺酸补充的小鼠其牛磺酸-GSH水平反映了牛磺酸浓度的变化，而GST活性保持不变。胆汁酸水平和组成受CR显著影响，但仅受膳食牛磺酸的适度影响。CR强烈影响胃肠道内的牛磺酸摄取，这在给予牛磺酸补充的小鼠中尤为明显。
研究中，LTD对肝脏中牛磺酸及其偶联物的影响远大于对小肠的影响。先前报告显示，大鼠在LTD下不仅肝脏，而且小肠、血液、肾脏、肌肉、大脑和脾脏中的牛磺酸水平均降低。有趣的是，在我们的实验中，与自由采食LTD对照组相比，CR LTD小鼠的回肠和血浆中牛磺酸及其偶联物水平升高。此外，虽然CR小鼠血浆在LTD下牛磺酸偶联物水平降低，但CR LTD的影响主要在于偶联物组成而非总体水平。相反，CR LTD并未显示粪便牛磺酸水平的进一步降低，而CR条件下粪便牛磺酸水平通常较低。
牛磺酸补充影响了回肠黏膜的牛磺酸水平，但对肝脏和血浆牛磺酸浓度的影响更为显著。先前报告指出，高牛磺酸饮食导致血浆、肝脏、小肠、肾脏、肌肉和肺中的牛磺酸水平增加。相反，Sturman等人报告称，补充牛磺酸对各组织牛磺酸浓度影响甚微，除肝脏和血浆外。事实上，在Sturman的研究中，肝脏牛磺酸含量受膳食补充显著影响；因此，尽管肝脏是合成牛磺酸的主要器官，但假设肝脏牛磺酸水平最受细胞外条件（包括饮食）变化的影响。重要的是，在小鼠和大鼠中，牛磺酸的生物合成受膳食牛磺酸可用性的调节。值得注意的是，人类合成牛磺酸的能力远低于小鼠和大鼠；因此，本研究结果不能直接外推到其他物种。
如前所述，限制和补充牛磺酸对肝脏中牛磺酸和牛磺酸偶联物水平的影响均大于对小肠的影响。这可能与肠道主要负责摄取和运输营养物质而非积累有关。此外，调节膳食牛磺酸水平并未改变肠道中的CR反应，例如在基因表达调节方面。值得注意的是，膳食牛磺酸似乎产生与CR相关的牛磺酸水平升高不同的结果，因为CR提高肠道黏膜而非肝脏的牛磺酸浓度，而膳食牛磺酸主要靶向肝脏而非肠道。因此，不同的机制调节膳食与限制相关的牛磺酸稳态。
最近研究表明，GSH可与牛磺酸自发形成偶联物，反应速率取决于GSH和牛磺酸的浓度。这可能解释了为何在GSH和牛磺酸浓度相对较高的肝脏中，它们的结合更可能非酶促发生。这反过来可以解释为何我们先前在CR肠道而非肝脏中发现GSTs的mRNA表达和活性增加。值得注意的是，补充牛磺酸不影响肝脏GST活性，进一步证实了肝脏中的非酶促结合。而在小肠中，即使在牛磺酸过剩的情况下，反应仍依赖于GSTs的活性，这可能反映了GSH浓度相对较低。值得注意的是，肠道黏膜中观察到的模式表明，CR相关的牛磺酸或其他CR介导的因素（而非膳食牛磺酸）影响GST基因表达。而肠道GSTs的酶活性以及牛磺酸-GSH水平更密切地对应于牛磺酸水平的变化，而非GSTs基因表达。
先前，Satsu H等人表明，肠道Slc6a6表达和牛磺酸摄取不受高牛磺酸饮食或LTD的影响。此外，牛磺酸转运蛋白是可饱和的，这可能是为何我们观察到补充的牛磺酸在自由采食动物中大部分随粪便排出的原因。值得注意的是，肾脏上皮Slc6a6的表达和活性受膳食含硫氨基酸调节，例如LTD上调而高牛磺酸饮食下调肾脏中的表达。因此，在喂食LTD的动物中，尿牛磺酸和牛磺酸分数排泄较对照组减少，而牛磺酸补充增加之。重要的是，正如我们所报告的，在CR期间，肠道Slc6a6表达和牛磺酸摄取增加，导致结肠和粪便中牛磺酸含量减少。现在研究表明，CR对牛磺酸摄取的影响强于膳食牛磺酸，因此，牛磺酸摄取增加在CR动物补充牛磺酸期间也得以维持。这很好地体现在牛磺酸补充下自由采食与CR肠道之间Slc6a6表达的差异得以维持，以及自由采食牛磺酸组与CR牛磺酸组之间粪便牛磺酸水平的显著差异。重要的是，摄入的过量牛磺酸几乎定量地在尿液和粪便中回收，而在我们最新的研究中，我们测量到CR动物肾脏中的牛磺酸浓度及其尿液分泌较自由采食小鼠增加。因此，CR牛磺酸组相对于自由采食牛磺酸组粪便牛磺酸分泌减少可能源于尿液与粪便分泌之间的重新分配。
CR期间牛磺酸肝脏合成增强的原因尚未揭示。一种有趣的可能性是，由于牛磺酸刺激胆汁酸产生，这可能是其在CR肝脏中的主要功能，其在肠道的释放仅是此过程的衍生物。牛磺酸增加小鼠Cyp7a1的mRNA表达和活性，并在体外HepG2细胞中也有类似作用。类似地，在本研究中，我们观察到牛磺酸补充后Cyp7a1表达轻微增加，并伴有TCA和TUDCA浓度升高。重要的是，对Shp没有影响。值得注意的是，在先前研究中，牛磺酸影响高脂肪/胆固醇饮食小鼠的CYP7A1，但不影响标准饲料小鼠。显然，在本研究中，牛磺酸对胆汁酸的影响相当温和，尽管实验中使用的牛磺酸量是研究牛磺酸与胆汁酸背景的文献中报道的五至十五倍。因此，CR期间牛磺酸水平的增加可能也不足以刺激胆汁酸合成，其他因素可能参与此调节。
这些发现对人类生理学的转化意义需谨慎考虑，鉴于啮齿动物与人类之间牛磺酸生物合成能力的巨大差异。人类的牛磺酸生物合成能力显著低于小鼠和大鼠，使得膳食牛磺酸摄入对维持组织水平更为关键。此外，胆汁酸结合谱在物种间差异显著，小鼠显示95%牛磺酸结合，而人类为30%。这些差异表明，膳食牛磺酸干预在人类中可能比在我们的小鼠模型中观察到的效果更为显著，特别是在肝脏和血浆牛磺酸水平方面。未来研究应纳入人体组织模型或临床研究，以验证牛磺酸补充作为CR模拟策略的治疗潜力。
此外，研究牛磺酸代谢和CR反应中的性别特异性差异是一个关键空白。本研究仅使用雄性小鼠，以保持与我们先前关于CR和牛磺酸的出版物一致。文献中记载了牛磺酸代谢和CR反应中的性别二态性，雌性显示出不同的牛磺酸生物合成率和独特的CR代谢反应。使用雄性小鼠限制了研究结果的普遍性，未来研究应检验此处观察到的膳食与CR诱导的牛磺酸调节之间的机制独立性是否也适用于雌性小鼠。本研究的一个关键考虑因素是CR干预的14天持续时间。选择这个时间框架是基于我们的经验，表明CR诱导的牛磺酸相关变化在第2周完全建立并在此后保持稳定。该方案在我们关于CR-牛磺酸的出版物中一贯使用，便于直接的机制比较。虽然该方案诱导代谢适应并有效捕获牛磺酸相关的CR结果，但长期CR可能揭示涉及组织结构重塑、免疫调节和细胞衰老的额外适应机制。膳食与CR诱导的牛磺酸调节之间的机制独立性在长期限制中是否持续存在，仍有待确定。
虽然一些CR方案采用微量营养素匹配饮食以分离热量效应与潜在的微量营养素缺乏，但我们采用了非补充方法。这样设计的主要原因是标准啮齿动物饲料的配方提供的营养素超过最低需求，即使在20% CR下也能确保足够的微量营养素摄入。此外，我们的CR方案涉及在14天短周期内实施的适度20%限制，通常被认为是温和的，不足以引起临床显著的副作用。最后，该方案反映了人类的饮食限制，其中CR很少伴随补偿性微量营养素补充。然而，我们承认这是一个局限性，因为不能排除细微的微量营养素波动对观察到的牛磺酸代谢变化有所贡献。未来研究使用匹配微量营养素的饮食计划，以及血浆微量营养素分析，可以提供更确凿的证据，并加强膳食牛磺酸调整与其效应之间的因果联系，独立于整体营养变异。
我们研究的另一个局限性是实验组之间的饲养条件差异。与自由采食组不同，CR动物被单独饲养，从而防止攻击行为并确保食物均匀分配。这种设计可能引入与社会隔离压力相关的混杂变量。尽管这不太可能影响牛磺酸代谢，但未来采用所有实验组平行饲养条件的研究应评估饲养条件对CR诱导代谢变化的独立贡献。
其他需要调查的关键问题包括牛磺酸补充与CR模拟效应在不同代谢结果之间的剂量反应关系、长期CR方案期间牛磺酸稳态变化的时间动态，以及组织特异性牛磺酸-谷胱甘肽偶联物在细胞保护机制中的功能意义。总之，通过膳食补充或限制调节牛磺酸水平并未影响CR相关的肠道牛磺酸水平升高和GST表达。此外，CR增加肠道而非肝脏的牛磺酸浓度，而膳食牛磺酸主要靶向肝脏而非肠道。因此，膳食牛磺酸似乎具有与CR相关的牛磺酸水平升高不同的影响，且在这两种情况下，结果都是组织依赖的。总体而言，我们的研究有助于细致理解膳食因素、代谢调节和牛磺酸代谢中组织特异性反应之间复杂的相互作用。本研究强调了针对特定组织定制饮食干预的重要性，可能导致管理代谢健康和肥胖的更有效策略。
