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支链淀粉与直链淀粉比例的快速电化学检测方法研究。通过ADH@pullulanase-AuNPs纳米花传感器实现淀粉比例的高灵敏检测，线性范围1×10??-1×10?? mol/L，检测限0.5×10?? mol/L，检测时间<10分钟，适用于大米产品的快速分析。
王岩|李凯|王振星|史磊宝|孙瑞松|张帅|贾英欣|郭秀英|张娜
哈尔滨商业大学食品科学与工程重点实验室，中国哈尔滨150076
摘要
淀粉是食品工业中重要的原材料，其中直链淀粉与支链淀粉的比例与淀粉产品的质量密切相关。因此，开发快速检测直链淀粉/支链淀粉比例的方法是满足工业发展的实际需求。因此，开发一种快速、灵敏且便携的检测方法具有重要意义。在本研究中，利用醇脱氢酶（ADH）和普鲁兰酶制备了ADH@普鲁兰酶-AuNPs生物传感器，建立了一种用于检测直链淀粉与支链淀粉比例的电化学方法。具体而言，通过调控Cu2+和PO43?与酶之间的相互作用，实现了ADH和普鲁兰酶的空间定位固定；同时，对AuNPs进行了修饰以提高其导电性。此外，还研究了该方法在水产品中的应用效果。实验结果表明，ADH@普鲁兰酶簇具有多孔的花状结构、良好的酶活性和优异的电化学性能。在最佳条件下，该方法对直链淀粉/支链淀粉比例的检测范围为1×10?6–1×10?4 mol/L，检测限为0.5×10?6 mol/L，检测时间小于10分钟。将其应用于水产品检测时，与碘比色法的平均相对偏差为6.9%。该方法的成功开发为现场快速、灵敏地检测直链淀粉/支链淀粉比例提供了技术参考和理论基础。
引言
淀粉作为作物中的常见营养成分，通常用作食品加工助剂，以改善食品的理化性质[1]。淀粉主要由直链淀粉和支链淀粉组成，这两种成分的比例与淀粉的糊化、老化和凝胶形成等理化性质密切相关[2]。直链淀粉与支链淀粉的比例不仅决定了基于淀粉的食品的风味和质量，还在评估其加工适应性方面起着重要作用。因此，在一定程度上，这一比例决定了淀粉的经济价值[3]。此外，直链淀粉与支链淀粉比例的检测广泛应用于多个领域，如含淀粉谷物的育种、淀粉的高值利用以及食品质量的保证[4]、[5]、[6]。同时，这一比例在食品配方开发、设备选择和食品加工参数设置中也起着重要作用[7]。近年来，随着食品工业的快速高质量发展，研究人员对更先进的淀粉质量检测技术提出了更高要求。因此，直链淀粉与支链淀粉比例的检测技术受到了广泛关注。
目前，碘量滴定、分子排阻色谱、马铃薯凝集素法和近红外光谱法被广泛用于直链淀粉与支链淀粉比例的检测[8]、[9]、[10]、[11]。这些分析方法虽然具有高灵敏度、良好重现性和高可靠性，但也存在一些局限性：操作繁琐、耗时、需要技术娴熟的人员、检测成本高且不适合现场应用。此外，在现有技术条件下，现场检测直链淀粉与支链淀粉比例被认为难以实现。电化学酶生物传感器因其高灵敏度、准确性和快速响应特性而被广泛用于现场快速分析[12]。研究表明，普鲁兰酶可以选择性地催化支链淀粉中的α-1,6-糖苷键，这表明其在淀粉含量定量分析中具有潜在的应用价值。基于普鲁兰酶的纳米花材料也表现出优异的稳定性和催化活性[13]。NAD+依赖的ADH可通过将辅酶NAD+还原为NADH来催化羟基的脱氢和氧化反应，从而促进电子转移[14]、[15]。基于这一原理，NAD+依赖的ADH可应用于电化学生物传感器中，用于定量检测系统中的羟基。
电化学酶生物传感器以酶作为识别成分，具有高选择性和灵敏度的优势。然而，其应用受到生物酶高成本和不稳定性的限制[16]。最近的研究采用了多种酶固定技术，以提高电化学酶生物传感器的灵敏度、稳定性和使用寿命[12]。纳米花是一种多孔的有机-无机杂化材料，具有较大的比表面积、强的吸附能力和高负载能力，使其成为酶固定的理想基底[17]。多项研究表明，将酶固定在纳米花基底上制备的生物传感器可用于多种分析物的定性和定量分析。例如，利用葡萄糖氧化酶纳米花在碳丝印电极上制备c-GOx@Cu-NF涂层膜，并通过该电化学传感平台进行葡萄糖检测[18]。
本研究首次提出了一种便携且用户友好的生物传感平台，用于电化学检测直链淀粉与支链淀粉的比例。该平台基于ADH@普鲁兰酶纳米花修饰在AuNPs上形成改性层，对直链淀粉和支链淀粉具有级联催化作用。ADH@普鲁兰酶-AuNPs生物传感器的制备过程简单：首先将普鲁兰酶在含有硫酸铜的磷酸盐缓冲液（PBS）中于4°C孵育24小时，然后加入ADH并继续孵育24小时，形成ADH@普鲁兰酶纳米花。将这些纳米花滴涂在AuNP修饰的电极上，得到ADH@普鲁兰酶-AuNPs生物传感器，并通过扫描电子显微镜（SEM）、共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）、紫外-可见光（UV–Vis）光谱、傅里叶变换红外（FTIR）光谱和电化学分析对其进行了表征。为了优化级联催化效果，系统调节了有机-无机杂化纳米花中ADH和普鲁兰酶的空间排列和质量比。在该系统中，ADH氧化直链淀粉非还原端的羟基[19]、[20]，随后普鲁兰酶水解支链淀粉，暴露出更多的非还原端，从而增强信号强度，确定总淀粉含量并计算比例。通过系统优化检测条件（缓冲液组成、pH值、扫描速率、缓冲液与样品溶液的比例和温度），该生物传感器在多种水产品中得到了验证。与传统方法[8]、[9]、[10]、[11]、[21]相比，所提出的生物传感器在快速、现场评估淀粉质量方面表现出更优越的能力。
化学试剂和材料
普鲁兰酶和PBS由广东翁江化学试剂有限公司（中国广东）提供。醇脱氢酶（ADH）和β-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD）来自上海阿拉丁生化科技有限公司（中国上海）。氯金酸由天津天利化学试剂有限公司（中国天津）提供。荧光素异硫氰酸酯（FITC）和罗丹明B异硫氰酸酯（RBITC）购自Gentihold生物技术有限公司（北京）。
ADH@普鲁兰酶纳米花的空间结构
纳米花的性质与其表面形态密切相关。因此，使用SEM对其结构进行了研究。SEM表征显示，ADH@普鲁兰酶纳米花具有明显的多孔性和不规则的花状形态（图1a–c）。从其表征结果可以清楚地观察到，所制备的结构具有典型的纳米花特征。
结论
总之，本研究成功开发了一种新型的ADH@普鲁兰酶-AuNPs电化学生物传感器，能够实现级联酶反应，准确灵敏地检测直链淀粉与支链淀粉的比例。该生物传感器具有宽的线性检测范围（1×10?6–1×10?4 mol/L）、低检测限（0.5×10?6 mol/L）和优异的抗干扰能力，明显优于现有方法。这种性能的提升归因于复合材料的独特多孔结构。
作者贡献声明
王岩：撰写 – 审稿与编辑、初稿撰写、项目管理、方法学设计、实验研究、概念构思。
李凯：撰写 – 审稿与编辑、初稿撰写、方法学设计、实验研究、概念构思。
王振星：撰写 – 审稿与编辑、实验研究。
史磊宝：实验研究。
孙瑞松：实验研究。
张帅：实验研究。
贾英欣：验证、资源协调、项目管理。
郭秀英：实验研究。
张娜：
利益冲突声明
作者声明不存在可能影响本文研究的已知财务利益或个人关系。
致谢
本研究得到了2021年哈尔滨商业大学教师创新项目支持计划（XL0062）和黑龙江省自然科学基金（PL2024C007）的支持。
