《Molecular Carcinogenesis》：TGFβ-Mediated Overexpression of Podoplanin Serves as a Potential Diagnostic Biomarker in Acute Promyelocytic Leukemia
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本研究揭示了TGF-β/SMAD信号通路转录调控足萼蛋白在急性早幼粒细胞白血病中高表达的分子机制。文章证实了PDPN(Podoplanin)在APL患者mRNA和蛋白水平的特异性高表达，其诊断效能（流式细胞术：AUC=0.95，灵敏度92.86%，特异性100%）优于传统免疫表型标记，并首次通过ChIP-qPCR证实SMAD蛋白与PDPN启动子直接结合，阐述了其通过介导血小板聚集参与APL凝血异常的病理过程，为APL的快速精准诊断提供了新的生物标志物和潜在干预靶点。
1 引言
急性早幼粒细胞白血病是一种由PML-RARα融合基因驱动的特殊亚型急性髓系白血病，其特征是异常早幼粒细胞在血液和骨髓中积累。尽管全反式维甲酸和三氧化二砷的靶向治疗取得了成功，但患者仍面临高达17%至30%的早期死亡风险，这主要归因于其独特的严重凝血病。鉴于APL与非APL AML在治疗和临床管理上的巨大差异，迫切需要准确区分两者的方法。近年研究表明，足萼蛋白在APL凝血病（尤其是血栓形成）中具有潜在作用。PDPN是一种跨膜糖蛋白，通过与血小板C型凝集素样受体2的相互作用，诱导血小板活化和聚集，从而促进疾病进展并与不良预后相关。PDPN在APL中的转录调控及其诊断潜力尚不清楚，本研究结合计算分析与分子验证，旨在探究PDPN的转录调控机制，并评估其作为可靠区分APL与非APL AML的诊断生物标志物的实用性。
2 材料与方法
研究共纳入73例临床样本，包括APL患者52例和非APL白血病患者21例。样本采集自诊断时的骨髓或外周血。APL细胞通过Ficoll/Histopaque密度梯度法分离。APL诊断通过欧洲抗癌计划设计的引物/探针组进行逆转录PCR分子确认。使用Trizol试剂提取总RNA，并通过实时定量PCR评估PDPN mRNA表达。使用10色多参数流式细胞术评估PDPN蛋白表达水平。此外，分析了来自TCGA-GDC门户和BEATAML1.0队列的公开基因表达数据。通过JASPAR数据库分析PDPN启动子序列中的转录因子结合位点。使用染色质免疫沉淀后定量PCR实验验证SMAD蛋白与PDPN启动子的物理相互作用。使用重组TGF-β1配体及其抑制剂Luspatercept处理APL细胞系NB4，并通过免疫印迹分析蛋白表达变化。通过酶联免疫吸附试验测量患者血清中TGF-β1配体水平。所有统计分析均使用GraphPad和R软件进行。
3 结果
3.1 患者的临床病理特征
52例经分子证实的新发APL和21例非APL AML患者样本纳入研究。APL诊断中位年龄为35岁。与AML相比，APL患者的凝血功能异常和血小板计数显著更高。52例APL病例中，27例出现出血表现。根据Sanz标准对患者进行风险分层。
3.2 PDPN在APL患者的mRNA和蛋白水平高表达
通过RQ-PCR观察到，APL患者的PDPN mRNA水平显著高于AML病例，中位拷贝数分别为848和1。对28例APL和21例AML患者的流式细胞术分析进一步支持了这一发现，APL中PDPN阳性细胞中位数为9.34%，而AML中仅为0.40%。对公开数据集的分析也显示，APL病例中标准化的PDPN转录本水平显著高于AML。
3.3 PDPN在APL中的临床和诊断意义
相关性分析显示，PDPN表达与血小板计数呈显著负相关。为了评估PDPN在区分APL与非APL AML中的诊断效用，使用PDPN mRNA水平和表面蛋白表达进行了ROC分析。以10个mRNA拷贝为临界值，PDPN鉴定APL的灵敏度为80.7%，特异性为71.43%。然而，PDPN蛋白表达显示出更优的诊断性能。以1.4%的PDPN阳性细胞为阈值，其灵敏度达92.86%，特异性达100%，突显了其作为APL诊断生物标志物的潜力。
3.4 PDPN启动子转录因子结合位点分析
前期报道提示TGF-β/SMAD信号通路在多种实体瘤中上调PDPN蛋白。为确定该通路是否作为PDPN的转录调节因子，首先检查了PDPN 5‘-侧翼启动子是否包含SMAD2/3结合位点。在JASPAR数据库中以90%的严格结合亲和力阈值筛选了PDPN启动子转录起始位点上游1kb的所有推定转录因子。在PDPN启动子的1200bp区域内发现了721个不同类别转录因子的推定转录因子结合位点。在远端和核心启动子区域观察到两个具有CCAGAC基序序列的SMAD2结合位点。
3.5 SMAD蛋白直接结合PDPN的5‘启动子序列
进一步验证了SMAD蛋白是否与PDPN上游启动子区域存在物理相互作用。使用NB4 APL细胞进行ChIP-qPCR。实验首先优化了染色质交联和片段化方案以获得平均150bp的片段大小。设计了两组qPCR引物，分别侧接两个SMAD2结合位点。初始条件下，使用SMAD4抗体的免疫沉淀产物未检测到富集的染色质片段。在用TGF-β1配体处理NB4细胞2小时后，观察到使用SMAD4抗体的免疫沉淀产物中染色质片段有五至七倍的富集，证实了SMAD复合物结合位点存在于PDPN启动子区域，并作为PDPN转录的转录因子。
3.6 TGF-β1通过SMAD信号通路上调APL细胞中的PDPN表达
为了评估TGF-β信号对PDPN表达的贡献，用重组TGF-β1配体处理NB4细胞24小时以激活TGF-β/SMAD信号通路。刺激后，发现SMAD2和SMAD3蛋白的磷酸化水平显著增加，同时PDPN表达上调。为了验证PDPN表达的上调是否源于TGF-β/SMAD通路的激活，首先用TGF-β配体抑制剂Luspatercept刺激NB4细胞，随后进行TGF-β1配体处理。发现经TGF-β1刺激但未用抑制剂处理的NB4细胞显示出PDPN和pSMAD2表达上调，而抑制剂处理的细胞在两个浓度下均显示PDPN和pSMAD2表达显著降低。随后，测量了APL和AML患者血清样本中的TGF-β1配体水平，以证实APL患者中PDPN的上调。结果发现，与AML患者相比，APL患者血清中的TGF-β1配体水平显著更高。这些综合结果表明，TGF-β/SMAD通路是APL细胞中PDPN上调的一个独立机制。
4 讨论
APL是AML中一个独特且侵袭性的亚型，若未及时诊断和治疗，患者将面临危及生命的凝血病高风险。近期报道足萼蛋白过表达与APL凝血病相关。然而，PDPN在APL中上调的分子机制及其诊断潜力在很大程度上仍未探索。本研究为PDPN在APL中的诊断能力及转录调控提供了见解。研究表明，与其他AML亚型相比，PDPN在APL患者中显著过表达，这一发现得到了两个独立的公共基因表达数据集的一致支持。值得注意的是，PDPN蛋白表达通过ROC分析显示出更高的灵敏度和特异性。PDPN的诊断优势在于其能够同时保持高灵敏度和高特异性，解决了传统标记物常为一方而牺牲另一方的关键缺口。最重要的是，PDPN在传统标记物失效的具有挑战性的诊断场景中表现出特别的临床价值。与主要依赖抗原缺失的现有标记物不同，PDPN代表了一个阳性诊断标记物，降低了假阳性结果的风险。将PDPN与传统标记物结合，可显著提高常规流式细胞术检测APL的准确性，并可能减少误诊病例。
虽然TGF-β/SMAD信号通路与实体瘤中PDPN的表达有关，但其在血液系统恶性肿瘤如APL中的直接作用仍有待研究。本研究确定TGF-β/SMAD信号通路是PDPN上调的主要驱动因素。对PDPN启动子的生物信息学分析揭示了保守的SMAD结合元件。ChIP-qPCR结果证明了SMAD蛋白与PDPN启动子的强结合，且在TGF-β1刺激后增强。这一发现首次揭示了SMAD蛋白作为转录因子直接结合PDPN启动子。此外，用TGF-β1配体处理APL细胞导致SMAD2/3通路的强烈激活和PDPN表达增加。相反，用Luspatercept抑制TGF-β信号可降低SMAD磷酸化和PDPN水平。研究还测量了患者血清中的TGF-β1水平，发现其在APL中显著高于非APL AML。这表明APL微环境中较高的TGF-β1配体水平维持了SMAD通路的激活和高PDPN表达。这一发现首次为TGF-β/SMAD信号如何促成APL中PDPN过表达提供了机制性见解。
总之，研究结果确立了PDPN作为APL中TGF-β/SMAD通路的下游效应因子，并突显了其作为APL诊断生物标志物的潜力。
