《Science Bulletin》：Local macrophage dynamics–inspired engineering of time-programmed nano-vaccine scaffold for postoperative cancer immunotherapy
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本研究发现术后肿瘤微环境中M2样TAMs的抗原呈递功能不足，开发E@M-HMV凝胶疫苗通过抑制溶酶体降解和表型重塑，延长炎症期，增强抗肿瘤免疫，减少复发和转移，并与免疫检查点阻断协同增效。
徐振宇|陈倩|郝明宇|曹一阳|匡晓琴|李春佳宇|刘志豪|薛嘉文|赵建宁|赵梦伟|蔡乃聪|李一清|吴艳萍|李昌|涂嘉胜|孙春萌
中国药科大学天然药物国家重点实验室，南京 211198，中国
摘要
关于巨噬细胞在非癌症伤口愈合过程中的时空动态已经有了广泛的研究；然而，肿瘤切除后局部肿瘤微环境（TME）中肿瘤相关巨噬细胞（TAMs）的动态却鲜有关注。本研究表明，在小鼠肿瘤切除后，由M1样TAMs主导的炎症阶段仅持续了大约2天，这远远短于身体建立有效抗肿瘤免疫所需的时间（7-10天）。此外，M2样TAMs的抗原交叉呈递并不会自发发生。受局部巨噬细胞动态的启发，我们开发了一种针对M2样TAMs的缓释癌症疫苗——E64封装的甘露糖修饰混合膜囊泡在凝胶中（E@M-HMV in gel），该疫苗能够有效重编程术后局部TME中M2样TAMs的表型和抗原交叉呈递功能。在具有原位三阴性乳腺癌原发瘤或远处瘤、皮下结肠癌和皮下肝细胞癌的小鼠中，将疫苗注射到肿瘤切除腔内可以引发强烈的肿瘤特异性免疫和长期免疫记忆，从而抑制肿瘤复发、术后肺转移以及进一步的肿瘤再挑战，尤其是与免疫检查点阻断联合使用时效果更佳。总体而言，我们的研究不仅阐明了术后TME中TAMs表型的变化模式，还为利用局部巨噬细胞进行高效肿瘤免疫治疗提供了有前景的方案。
引言
随着过去十年医学技术的不断进步，出现了许多新的癌症治疗方法；然而，手术仍然是实体瘤的主要和最有效的治疗方法[1]，[2]。然而，手术创伤引起的免疫抑制会削弱免疫反应，增加围手术期肿瘤复发和转移的风险[3]，[4]，[5]，[6]。这种免疫系统的削弱主要归因于肿瘤相关巨噬细胞（TAMs）[7]，许多临床前和临床研究都表明TAMs与术后高肿瘤复发率有关[8]，[9]，[10]。因此，将TAMs重编程为抗肿瘤的M1表型已成为一种重要的治疗策略[11]，[12]。在正常的伤口愈合和组织修复过程中，单核细胞衍生的巨噬细胞（M0表型）不断被招募到局部肿瘤微环境（TME）中，并从以M1样巨噬细胞为主的炎症阶段过渡到以M2样巨噬细胞为主的再生阶段[13]，[14]，[15]，[16]，[17]。考虑到巨噬细胞的可塑性及其在肿瘤共进化过程中的广泛表型和功能变化，非癌症创伤背景下M1样和M2样巨噬细胞之间动态变化的经验理解并不适用于肿瘤相关情况。然而，关于肿瘤伤口中M1样与M2样TAMs动态的报道非常少。因此，确定TAMs的主导表型转换时间点对于选择术后癌症管理方法和基于TAM重编程的疗法时机至关重要。
由于手术不可避免地会去除许多增强对残留肿瘤免疫反应的抗原，术后辅助治疗对于恢复免疫防御至关重要[18]，[19]，[20]，[21]，[22]。治疗性癌症疫苗是一种新型的术后疗法，通过靶向肿瘤抗原来帮助消除小的残留病灶并建立长期的抗肿瘤免疫记忆[23]，[24]，[25]，[26]。全肿瘤抗原疫苗尤其有效，因为它们可以靶向多种已知和未知的抗原，防止因抗原丢失而导致的免疫逃逸[27]。在辅助建立抗肿瘤免疫的疫苗背景下，抗原呈递至关重要。抗原呈递细胞（APCs）作为这一过程的执行者，在肿瘤抗原的摄取和交叉呈递中起着关键作用，激活CD8+ T细胞[28]，[29]。尽管树突状细胞（DCs）在这一功能中最为著名[30]，[31]，[32]，巨噬细胞也可以以这种方式呈递抗原[33]，[34]。鉴于TAMs在术后TME中数量更多且具有更强的吞噬能力，它们在激活CD8+ T细胞方面具有潜力[35]，[36]，[37]，[38]。然而，M2样TAMs中增强的溶酶体活性可能导致抗原过度降解，从而影响有效的抗原交叉呈递和CD8+ T细胞的激活。此外，从炎症阶段向再生阶段的过渡是不可避免的。因此，设计一种调节溶酶体活性的方法来恢复M2样TAMs的抗原呈递功能对于预防癌症复发和转移具有很大潜力。
在本研究中，我们注意到与非癌症创伤相比，肿瘤切除后伤口部位的炎症阶段缩短，导致难以建立有效的抗肿瘤免疫反应。我们还确定了TAMs的主要表型转换点。基于这些发现，我们将具有强免疫激活能力的细菌外膜囊泡（OMVs）与肿瘤膜囊泡（TMVs）融合形成混合膜囊泡（HMVs），并通过代谢糖链工程在HMV表面修饰甘露糖，生成M-HMVs（图1a）。这种混合纳米平台通过向APCs递送佐剂和抗原来增强免疫激活和抗原呈递，效果优于OMVs和TMVs的简单混合物。此外，甘露糖配体能够有效靶向并重编程术后TME中的M2样TAMs，从而延长以M1样TAMs为主的炎症阶段（图1b）。此外，甘露糖受体（MR）介导的内吞作用使货物更倾向于定位于I类呈递途径的内体中，增加了肿瘤抗原交叉呈递的概率。我们通过将半胱氨酸蛋白酶抑制剂E-64加载到M-HMV腔内来开发E@M-HMV（图1a）。E-64的添加抑制了内体中肿瘤抗原的水解，恢复了M2样TAMs的交叉呈递功能，从而促进了CD8+ T细胞的激活（图1b）。自由形式的癌症疫苗在体内容易降解和快速代谢，导致无法及时捕获抗原并触发有效的抗肿瘤免疫反应。为了解决这个问题，我们将E@M-HMV与藻酸盐（Alg）水凝胶结合，设计了一种缓释的癌症E@M-HMV疫苗在凝胶中（图1a）。这种治疗方法模拟了自然感染，提供了超过1周的稳定抗原刺激，增强了肿瘤特异性免疫反应并建立了免疫记忆，有效抑制了肿瘤复发和转移。E@M-HMV在凝胶中在多种癌症术后模型中缓解了肿瘤进展，显示出良好的多功能性和临床转化潜力。此外，E@M-HMV在凝胶中与免疫检查点阻断（ICB）疗法联合使用，进一步改善了治疗效果（图1b）。总体而言，E@M-HMV在凝胶中可以重新编程术后TME和现有M2样TAMs的抗原交叉呈递功能，为癌症术后辅助治疗提供了强有力的策略。
小节片段
在小鼠中建立术后癌症模型
为了建立术后癌症模型，雌性Balb/c小鼠被接种肿瘤细胞：将4T1小鼠乳腺癌细胞（1×106）注射到左侧第四乳腺脂肪垫中。另外，将CT26和HC22小鼠癌细胞（各1×106）皮下注射到颈部后方的背部区域。监测原发肿瘤的生长情况。一旦肿瘤体积达到150–300 mm3，就进行手术切除。
肿瘤缩短了术后伤口中由M1样TAMs主导的炎症阶段
在非癌症伤口愈合和组织修复过程中，单核细胞衍生的巨噬细胞在受伤后约第5天被招募到伤口部位，并从中性阶段过渡到炎症阶段，最终进入再生阶段[39]，[40]。为了探讨癌症手术后局部TME中的免疫激活过程，在切除后不同时间点对小鼠进行安乐死，收集残留肿瘤（图2a和在线图S1）。这些免疫细胞的表型
讨论
手术是大多数实体瘤的首选治疗方法[4]。然而，最近的研究表明，手术可能导致局部癌症复发和转移[5]，[6]。手术后，免疫细胞的分化和功能会发生显著变化。特别是，巨噬细胞的表型和功能会根据特定的手术程序发生改变[12]。这种可塑性使巨噬细胞在伤口愈合和组织修复中发挥多种作用[13]，[14]，[15]，[16]，[17]。
结论
我们的研究关注了小鼠癌症手术后伤口部位巨噬细胞的表型变化；据此设计了缓释癌症疫苗E@M-HMV in gel。这种疫苗针对伤口微环境中的M2样TAMs，将其重编程为M1表型，从而延长炎症阶段并恢复其溶酶体功能，改善抗原交叉呈递。在多种癌症术后小鼠模型中，E@M-HMV in gel增强了适应性免疫反应
致谢
本研究得到了国家自然科学基金（22478438、82303820、82273882和22278442）、江苏省杰出青年科学基金（BK20240098）、江苏省自然科学基金（BK20231017）以及中国药科大学天然药物国家重点实验室的专项研究基金（SKLNMZZ2024JS19）的支持。
作者贡献
徐振宇提出了项目构想，开发了研究方法，领导了研究工作
