通过逐层涂覆并添加Ag和3PO4来对钛进行抗菌改性

摘要层叠自组装技术制备含Ag3PO4颗粒的钛合金复合涂层，通过XRD、SEM-EDX和FT-IR分析证实涂层表面形成Ag3PO4/Ag2O结晶，表面粗糙度（Ra=1.41-1.75 μm）和接触角（54.4-73.6°）显著优于抛光钛，涂层结合力良好，抗菌活性对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌有效（MIC=5 μg/mL），细胞实验显示涂层促进骨细胞附着与增殖。

　　

J. Busumabu|K. Fatima|H.L. Fan|H.X. Xie|Z.H. Gan|L. Xie|X. Ma|T. Fu

中国西安交通大学生命科学与技术学院，教育部生物医学信息工程重点实验室，西安 710049

摘要

为了提高钛制骨科植入物的抗菌效果和细胞相容性，制备了层层复合涂层。首先对钛材进行碱热处理，然后分别涂覆聚(L-赖氨酸)的阳离子层，接着交替涂覆负载Ag₃PO₄颗粒的明胶阴离子层和壳聚糖阳离子层，重复此过程若干次。XRD、SEM-EDX和FT-IR分析表明，涂层表面存在Ag₃PO₄/Ag₂O晶体以及有机成分。与抛光钛材相比，涂层样品具有更高的表面粗糙度（Ra=1.41-1.75 μm）和更小的接触角（54.4-73.6°）。通过胶带剥离法测试，涂层样品的附着力良好。浸入水中后，涂层中的银（Ag）和磷（P）浓度逐渐降低。电化学腐蚀实验表明，经过预处理和涂层的钛材比抛光钛材具有更好的耐腐蚀性。该复合涂层对大肠杆菌（E. coli）和金黄色葡萄球菌（S. aureus）表现出有效的抗菌活性，Ag₃PO₄颗粒的最低抑菌浓度为5 μg/mL。添加Ag₃PO₄颗粒会影响MC3T3-E1细胞在涂层上的附着和存活能力。这种层层自组装（LBL）方法可以为钛制骨科植入物表面改性提供附着力强、抗菌效果好且细胞相容性可调的涂层。

引言

骨科和牙科植入物在肌肉骨骼疾病的治疗中起着关键作用，它们提供结构支撑并促进愈合过程。由于钛及其合金具有良好的拉伸强度、低密度、耐腐蚀性和优异的生物相容性，因此常用于骨骼和牙齿替换[1,2]。尽管钛植入物有许多优点，但植入物表面的细菌存在和生物膜的形成对植入物的成功使用构成了重大威胁[3],[4],[5]。生物膜是一种复杂的微生物群落，对传统抗生素具有抗性，会导致慢性感染、植入物失效甚至健康问题[2,4,6,7]。大多数情况下，商业化的钛植入物表面容易受到细菌侵袭，无法抵抗细菌附着[8,9]。植入物的生物活性受到表面性质、环境因素（如pH值和温度）以及表面形成的生物膜敏感性的强烈影响[8,10,11]。因此，必须采取措施改善植入物表面的物理和化学性质，以防止细菌生长并增强骨结合和植入物固定[3,8,12,13]。

通过涂覆生物活性分子、被动/主动聚合物和抗菌涂层来改善钛植入物的表面性能，在骨科和牙科领域引起了广泛关注，因为这些特性对于提高植入物的生物相容性、抗菌性能和促进骨细胞生长至关重要[14],[15],[16],[17]。已经开发出多种涂层技术来为骨科和牙科植入物加载抗生素[3,18]。然而，高剂量和滥用抗生素可能导致抗生素耐药性的产生以及人体内的毒性[2]。常用的抗生素包括甲氧西林、苯唑西林、青霉素、阿莫西林、头孢菌素、链霉素、四环素、磺胺类药物和万古霉素[3,19]。目前仍难以制备出能够在较长时间内以恒定浓度释放抗生素的聚合物涂层。

无机抗菌剂（如银（Ag）、铜（Cu）、锌（Zn）、Ag₂O、ZnO、TiO₂等）相比有机抗菌剂具有优势，如强大的抗菌活性、降低药物耐药性风险、良好的生物相容性和稳定性[2,18,20]。银及其化合物常被用作医疗器械涂层的抗菌剂[8],[21],[22],[23]。含银涂层的抗菌机制包括释放游离金属离子、生成活性氧化物质（ROS）、干扰微生物膜、生物分子和遗传物质的正常功能，以及通过抑制细菌生长来作用于宿主的免疫系统[24,25]。Ag₃PO₄具有抗菌功能，并能释放磷酸根离子作为骨细胞的营养来源[24,25]。作为一种半导体，它还具有光活性，适用于潜在的光动力治疗[26],[27],[28]。因此，预计在涂层中加入Ag₃PO₄可以增强抗菌效果、改善植入物的骨修复能力，并治疗骨骼及其他疾病（如骨髓炎、牙周炎、假体周围感染）[24,29]。

层层自组装（LBL）是一种新的骨科植入物涂层方法[14]。与其他有机薄膜制备方法（如非活性吸附、硅烷偶联、Langmuir-Blodgett薄膜等）相比，该方法在钛表面连续沉积LBL涂层时使用的活性化学物质较少，且更有利于保持生物分子的活性[15,16]。LBL涂层方法依靠静电作用力交替吸附阳离子和阴离子聚合物及其功能成分[14,16,17]。常用的阳离子聚合物包括聚(L-赖氨酸)（PLL）、聚乙二醇（PEG）、壳聚糖（Chi）、聚合物刷、聚(2-氧氮杂环丙烷)等，阴离子聚合物通常为明胶（Gel）和透明质酸。LBL涂层技术使每一层都能在表面稳定组装，从而在复合构建过程中形成带电的最外层。由于细菌膜外侧存在负电荷磷脂，最外层带正电荷，能够主动吸附细菌[5,30],[31],[32],[33],[34],[35]。LBL涂层具有良好的生物降解性和生物相容性，还能促进细胞附着和增殖。

LBL自组装技术为将功能成分整合到复合结构中提供了一个可控且可定制的平台[14,23],[36],[37],[38],[39]。例如，利用带正电的壳聚糖和多巴胺以及带负电的透明质酸和银颗粒，在玻璃上设计了抗菌且生物相容的复合LBL涂层[40]。在棉织物上制备了负载银颗粒的壳聚糖和聚(苯乙烯磺酸盐)抗菌LBL涂层[41]。负载银颗粒的LBL薄膜在纳米多孔聚砜表面上表现出良好的固定效果[42]。

钛材在碱性溶液（60 °C）和去离子水（80 °C）中处理后表面带有完全负电荷[16]。羟基的形成、表面能的增加和形态变化可以提高钛的生物活性、骨细胞增殖和分化能力[2,14,16,43]。尽管植入物表面的抗菌涂层已得到广泛研究，但据我们所知，利用LBL自组装方法制备的有机-无机复合涂层在钛材上的应用在文献中较为罕见。因此，我们开发了一种具有多种功能的新型钛涂层，如抗菌、与骨细胞相容以及物理化学稳定性。这种LBL自组装涂层由PLL底层和交替涂覆的负载Ag₃PO₄颗粒和壳聚糖的层组成。已对该复合涂层的结构、润湿性能、抗菌活性及体外细胞试验进行了研究。

材料与化学品

市售的TA2级钛板厚度为1.2毫米，切割成10×10毫米2的小块。NaOH、甘油和冰醋酸为分析试剂。Ag₃PO₄（99%）购自上海Macklin公司。聚-L-赖氨酸（[C₆H₁₂N₂O]_n，n=25-35，≥95%）、明胶（凝胶强度约100克/克）和壳聚糖（[C₆H₁₁NO₄]_n，脱乙酰度96.5%，粘度100-200 mPa?s）购自上海Aladdin公司。所有化学品均使用其市售形式。

采用层层法制备复合涂层样品

Ag₃PO₄颗粒的粒径分布与分散

如图2a所示，Ag₃PO₄颗粒在水中会沉淀，但在含有明胶和甘油的介质中1小时后变得稳定。中间试管在1小时后呈现淡黄色，表明Ag₃PO₄颗粒因在酸性介质中溶解而粒径减小。通过动态光散射技术立即评估了Ag₃PO₄颗粒的粒径分布，结果如图2b所示，中性水中的Ag₃PO₄颗粒粒径约为300纳米

结论

含有Ag₃PO₄颗粒的明胶溶液是稳定的。在经过碱热处理的钛基底上，使用聚(L-赖氨酸)溶液、明胶悬浮液和壳聚糖溶液制备了含有Ag₃PO₄颗粒的层层薄膜。与抛光钛材相比，涂层样品具有更高的表面粗糙度（Ra=1.41-1.75 μm）和更小的接触角（54.4-73.6°）。通过胶带剥离法测试，涂层样品的附着力良好。浸入水中后，涂层中的银（Ag）和磷（P）浓度逐渐降低

CRediT作者贡献声明

J. Busumabu：概念构思、形式分析、实验设计、方法论研究、初稿撰写。K. Fatima：实验设计、方法论研究、初稿撰写。H.L. Fan：形式分析、资源提供、审稿与编辑。H.X. Xie：实验设计、方法论研究。Z.H. Gan：资源协调、验证工作。L. Xie：资金筹集、项目管理、监督工作。X. Ma：资金筹集、资源提供、监督工作。T. Fu：项目管理、资源提供、监督工作、验证工作、终稿撰写 -

CRediT作者贡献声明

J. Busumabu：初稿撰写、方法论研究、形式分析、概念构思。K. Fatima：初稿撰写、方法论研究。H.L. Fan：审稿与编辑、资源提供、形式分析。H.X. Xie：方法论研究。Z.H. Gan：验证工作、资源协调。L. Xie：监督工作、项目管理、资金筹集。X. Ma：监督工作、资源提供、资金筹集。T. Fu：审稿与编辑工作、监督工作、资源提供、项目管理 -

利益冲突声明

作者声明在本研究中不存在利益冲突。

致谢

本研究得到了中国国家重点研发计划（项目编号：2023YFF1105302）、西安市科技计划（项目编号：25YXYJZD00010）以及西安交通大学医教研一体化创新项目（项目编号：YXJLRH2022022）的支持。作者感谢西安交通大学仪器分析中心的Y.N. Chen女士提供的SEM分析帮助。